在质粒载体中进行定向克隆实验
实验方法原理 大多数常用质粒都含有可被不同内切酶识别的多克隆位点。由于可供选择的克隆位点很多 [ 如 Invitrogen 公司的 PSE280 质粒的克隆位点有 46 个之多，而且还可以设计含有更多克隆位点的多聚接头（Brosius 1992 ) ]，因此一般来说总是能够找到一个带有与某一特定外源 DNA 片段末端相匹配的酶切位点的质粒载体。实验材料 T4 噬菌体 DNA 连接酶限制性内切核酸酶试剂、试剂盒 ATP乙醇苯酚氯仿乙酸钠TE仪器、耗材 琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶旋转柱层析装置实验步骤 一、材料1. 缓冲液和溶液ATP (10 mmol/L)，乙醇，苯酚：氯仿（1:1, V/V)，乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2)，TE ( pH 8.0)。2. 酶与缓冲液T4 噬菌体 DNA 连接酶，限制性内切核酸酶3. 凝胶琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶。4. 核酸和单核苷酸载体 DNA ( 质粒），外源或目的 DNA 片......阅读全文
酵母细胞中质粒的加工实验
定位突变质粒缺口修复技术和等位基因修复技术实验材料酵母菌株试剂、试剂盒带选择标记的YRp或YCp质粒适当的限制性内切核酸酶相应选择标记突变的酵母菌质粒标记的选择培养基平板仪器、耗材培养皿实验步骤1）将目的基因亚克隆到带恰当的选择标记的YRp或YCp质粒上。2) 在基因内部的两个限制酶酶切位点上切割以
酵母细胞中质粒的加工实验
实验方法原理 在非选择性生长条件下，大多数大肠杆菌/酵母菌穿梭载体的丢失频率大约1%。 在本方案中含质粒的酵母菌株接种于非选择性平板上以分离质粒并可得到单菌落。然后通过影印到选择性平板上可以鉴别丢失了质粒的菌株实验材料 含质粒的酵母菌株试剂、试剂盒 YPD或其他非选择性液体培养基及平板CM缺失成分
基因的转移与重组体的筛选和鉴定3
2. 定向克隆使目的基因按一定的方向插入载体的克隆方案称为定向克隆。最常用的定向克隆方案使用两种限制性内切酶切割载体和目的基因，从而在载体和目的基因两端产生非同源互补的两个粘性末端。定向克隆也可以通过在一端造成平端，另一端产生同源粘性末端实现年-平连接。定向克隆有效的限制了自身环化，并且实现了目的基
菌落PCR
实验方法原理 直接挑取菌落进行PCR，PCR的95℃加热可以破胞，释放基因组DNA或质粒，成为PCR体系的模板，然后进行链式扩增。 实验材料 菌落样品
菌落PCR
菌落PCR可用于：（1）重组体的筛选；（2）重组体DNA测序分析。实验方法原理直接挑取菌落进行PCR，PCR的95℃加热可以破胞，释放基因组DNA或质粒，成为PCR体系的模板，然后进行链式扩增。实验材料菌落样品试剂、试剂盒dNTPPCR混合液仪器、耗材PCR仪实验步骤1. PCR混合液的制备（1）
LITMUS38i载体载体的基本信息和质粒图谱
LITMUS38i载体载体基本信息载体名称LITMUS38i载体抗性Ampicillin载体长度2814 bp载体类型Basic Cloning Vectors载体来源Evans PD, Cook SN, Riggs PD, Noren CJ.拷贝数High copy number克隆方法Enzym
pTrcHis2－B载体载体的基本信息和质粒图谱
pTrcHis2 B载体载体基本信息载体名称pTrcHis2 B载体抗性Ampicillin载体长度4404 bp载体类型Basic Cloning Vectors载体来源Invitrogen (Life Technologies)拷贝数High copy numberpTrcHis2 B载体质粒图
怎么对提取质粒进行鉴定
首先跑一个琼脂糖凝胶电泳，观察一下带型和大小是否符合，然后根据质粒所含有的酶切位点，选择合适的限制性内切酶进行单酶切或双酶切，观察酶切后的条带数和大小是否与理论一致。
各家cDNA文库构建试剂盒优缺点比较
Invitrogen的:采用的是Gateway技术：利用λ噬菌体位点特异重组系统的BP和LR双向反应，首先将PCR产物用传统方法克隆到Gateway化的入门载体，这个目标基因就可以迅速方便而且定向地重组到任何Gateway化的表达载体上.优点:1无需限制酶切、无需连接，只要利用重组酶就可以穿梭于任何
pRSET－A载体的基本信息和质粒图谱
pRSET A载体载体基本信息载体名称pRSET A载体抗性Ampicillin载体长度2897 bp载体类型Basic Cloning Vectors载体来源Invitrogen (Life Technologies)拷贝数High copy numberpRSET A载体质粒图谱
BlueScribe载体的基本信息和质粒图谱
载体基本信息载体名称BlueScribe载体抗性Ampicillin载体长度2746 bp载体类型Basic Cloning Vectors载体来源Short JM, Fernandez JM, Sorge JA, Huse WD.拷贝数High copy number启动子T3克隆方法Enzyme
pInvRecA载体的基本信息和质粒图谱
pInvRecA载体载体基本信息载体名称pInvRecA载体抗性Ampicillin载体长度7354 bp载体类型Basic Cloning Vectors载体来源Sektas M, Gregorowicz M, Szybalski W.拷贝数Low copy numberpInvRecA载体质粒图
pBS(+)载体的基本信息和质粒图谱
pBS(+)载体载体基本信息载体名称pBS(+)载体抗性Ampicillin载体长度3204 bp载体类型Basic Cloning Vectors拷贝数High copy number5'引物M13 fwd3'引物M13 revpBS(+)载体质粒图谱
pMiniT载体的基本信息和质粒图谱
pMiniT载体载体基本信息载体名称pMiniT载体抗性Ampicillin载体长度2525 bp载体类型Basic Cloning Vectors载体来源New England Biolabs拷贝数High copy numberpMiniT载体质粒图谱
质粒克隆载体的设计和构建的原则
①选择合适的出发质粒出发质粒也叫亲本质粒，它应含有质粒克隆载体必备的元件，如复制起始位点、选择标记基因、克隆位点、启动子和终止子等。②正确获得构建质粒克隆载体的元件一般采用限制性核酸内切酶切割出质粒DNA分子，获得含有某种元件的DNA片段，还可以采用PCR技术从靶DNA中扩增出含某种元件的特异性DN
pUAST载体的基本信息和质粒图谱
pUAST载体载体基本信息载体名称pUAST载体抗性Ampicillin载体长度8897 bp载体类型Basic Cloning Vectors载体来源Brand AH, Perrimon N.拷贝数High copy numberpUAST载体质粒图谱
pBS()载体的基本信息和质粒图谱
pBS(-)载体载体基本信息载体名称pBS(-)载体抗性Ampicillin载体长度3204 bp载体类型Basic Cloning Vectors拷贝数High copy number5'引物M13 fwd3'引物M13 revpBS(-)载体质粒图谱
pTrcHis－A载体的基本信息和质粒图谱
pTrcHis A载体载体基本信息载体名称pTrcHis A载体抗性Ampicillin载体长度4414 bp载体类型Basic Cloning Vectors载体来源Invitrogen (Life Technologies)拷贝数High copy numberpTrcHis A载体质粒图谱
pDD载体的基本信息和质粒图谱
pDD载体载体基本信息载体名称pDD载体抗性Ampicillin载体长度3040 bp载体类型Basic Cloning Vectors载体来源Clontech拷贝数High copy number5'引物M13 fwd3'引物M13 revpDD载体质粒图谱
pBR322与－pUC质粒载体相比优点
（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数如pUC8为2 750bp，pUCl8为2 686bp，控制质粒复制rop基因的缺失，平均每个细胞即可达500～700个拷贝（2）适用于组织化学法检测重组体通过a-互补作用，利用菌落颜色筛选重组子。（3）具有多克隆位点区段（MCS）可以定向克隆防止载体自我连接。
质粒抽提实验中溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各有什么作用
溶液Ⅱ主要成分为氢氧化钠(NaOH)和SDS。DNA在pH5～9的溶液中是稳定的，但当pH＞12或pH＜3时，就会引起DNA双链之间氢键的解离而变性。溶液Ⅱ中NaOH浓度为0.2mob/L，加入溶液Ⅱ后，该系统的pH为12.0～12.6，因而促使染色体DNA与质粒的变性解离成单链。SDS是一种阴离子
质粒抽提实验中溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各有什么作用
溶液Ⅱ主要成分为氢氧化钠(NaOH)和SDS。DNA在pH5～9的溶液中是稳定的，但当pH＞12或pH＜3时，就会引起DNA双链之间氢键的解离而变性。溶液Ⅱ中NaOH浓度为0.2mob/L，加入溶液Ⅱ后，该系统的pH为12.0～12.6，因而促使染色体DNA与质粒的变性解离成单链。SDS是一种阴离子
外源DNA和质粒载体的连接反应原理及实验步骤1
外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂
外源DNA和质粒载体的连接反应原理及实验步骤2
10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)50mmol/K MgCl250mmol/L二硫苏糖醇500μg/ml 牛血清白蛋白（组分Ｖ.Sigma产品）（可用可不用）该缓训液应分装成小份，贮存于－20℃。另外，再设立两个对照反应，其中含有（1）只有质粒载体；（
瞬转中，质粒在细胞里会复制吗
质粒复制与否取决于你用的瞬转系统。有两个高表达的瞬转系统是能够保证质粒复制的：基于SV40病毒大T抗原的复制系统，如：HEK293T + 含SV40复制原点的质粒系统基于EBV病毒EBNA1蛋白的复制系统，如：HEK293E+含EBV复制原点的质粒系统其他的瞬转系统应该是不能复制，因而表达量低
毕赤酵母表达（pichia－pastoris－expression－）实验手册（6）
随着PCR技术的不断发展成熟（扩增长度、保证性、产量和特异性等），质粒构建过程的大多数细胞内的DNA复制将被PCR这一细胞外的DNA复制所代替，质粒构建效率将有质的飞跃。4.4密码子的偏好性的原则酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关。了解表达系统宿主在密码子使用上的偏爱性对从翻译水平分
酵母细胞中质粒的加工实验——从酵母细胞中分离质粒
利用一个假定的突变通过互补作用克隆酵母菌基因的一般方法。该突变为cdc101-1，它对酵母菌的生长来说既是隐性的又是温度敏感的。它使酵母可以很正常地在30°C生长，而不能在37°C形成菌落。如果用一个酵母菌基因组文库转化cdc101-1菌株，通过分离温度不敏感菌落，那么就可能分离到一个可以互补这种突
菌落PCR（Colony－PCR）方法
菌落PCR（Colony PCR）可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。具体方法：1、PCR混合物的制备T
克隆载体的准备实验
许多载体及其衍生物被开发出来用于克隆 PCR 产物，其中包括典型的 pBluescript 类载体。它们具有多克隆位点和简化的多克隆位点，PCR-Script Direct 质粒也是这样。简化的多克隆位点允许使用者把常用的限制酶位点整合到 PCR 引物中，同时还避免了相同的目标序列同时出现在质粒载体
定向克隆技术的概念
再将二者用DNA连接酶连接起来的方法，该法可以使外源DNA以固定的方向插入到载体中，亦可避免载体的自身环化。一般以单链噬菌体作为载体。