重组质粒（dnarecombinantplasmid）的连接、转化及筛选1
第一节 概 述质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆 较小的DNA 片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆 ,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA 和目的DNA 片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA 的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA 片段和载体DNA 的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆 策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。外源DNA 片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：1、带有非互补突出端的片段 用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆 的DNA 片段，一般情......阅读全文
质粒转化
[ 基本原理 ] 将质粒 DNA 导入细菌的过程称为转化（ Transformation ）。此感受态细菌细胞在 CaCl 2 低渗溶液中膨胀为球状（感受态细菌的制备，见前）。质粒 DNA 与 CaCl 2 形成抗 DNase 羟基 - 磷酸钙复合物黏附于细菌表面，经 42℃ 短时间热冲
质粒提取
一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤:细菌培养物的生长。细菌的收获和裂解质粒DNA的纯化。(一)细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载
关于DNA重组的重组修复介绍
有丝分裂和减数分裂期间由各种外源因子（例如紫外线，X射线，化学交联剂）引起的DNA损伤都可以通过同源重组修复机制（HRR）来修复。 人类和啮齿动物中减数分裂期间HRR所必需的基因产物的缺陷会导致不育 。人类HRR所必需的基因产物（例如BRCA1和BRCA2）的缺陷同时会增加患癌症的风险。在细菌
质粒DNA提取时质粒为何会丢失
中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选 用
DNA重组
目的：简单介绍了DNA重组技术的一些方法。包括重组质粒、PCR等。包括细胞结构、DNA，DNA如何改点等。
位点特异重组的重组机制介绍
位点特异性重组本质上是两个重组位点的四股DNA发生两次切割和两次连接的过程，所需的关键成分是重组酶（ recombinase），此外还需要一些蛋白因子。这里以入噬菌体DNA与大肠杆菌DNA整合而进入溶原状态为例，介绍位点特异性重组机制（图2-33）。 1．第一次切割重组酶（又称入噬菌体整合酶，
关于基因重组的自然重组的介绍
自然界不同物种或个体之间的基因转移和重组是经常发生的,它是基因变异和物种进化的基础。自然界的基因转移的方式有： 接合作用：当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时,质粒DNA就可从一个细胞（细菌）转移至另一细胞(细菌）,这种类型的DNA转移称为接合作用（conjugation ）。 转化作用（
质粒提取（三）
10)按步骤8)所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体(2-5)分钟。11)用50μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振荡，贮存于-20℃。注:
质粒的制备
质粒的制备可以用于（1）携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用；（2）质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。实验方法原理在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调
质粒的制备
实验材料 大肠杆菌菌液试剂、试剂盒 LA培养基LB培养基75%乙醇仪器、耗材 摇床离心机超净台TE
质粒的制备
实验方法原理 在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态
阅读质粒图谱
载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。一、一个合格质粒的组成要素 复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ 多克隆
质粒是什么
质粒（plasmid）是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体（或拟核）以外的DNA分子，存在于细胞质中，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，是闭合环状的双链DNA分子。质粒不是细菌生长繁殖所必需的物质，可自行丢失或人工处理而消除，如高温、紫外线等。质粒携带的
什么是质粒
染色体以外能自我复制的遗传因子。不具有胞外期，对寄主细胞来说是非必需的。质粒可能是DNA或RNA。质粒DNA不仅存在于细菌、蓝藻等原核生物中、在酵母、丝状真菌、植物、动物和人类等真核细胞中也有发现。除少数已鉴定出它们所编码的遗传性状以外，大多数是功能尚未清楚的隐蔽质粒。RNA质粒包括独立于寄主细胞染
质粒的概念
质粒：原核、细菌、小环DNA。松弛型和严紧型2类。
质粒是什么
质粒（plasmid）是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体（或拟核）以外的DNA分子，存在于细胞质中，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，是闭合环状的双链DNA分子。质粒不是细菌生长繁殖所必需的物质，可自行丢失或人工处理而消除，如高温、紫外线等。质粒携带的
质粒是什么
质粒（plasmid）是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体（或拟核）以外的DNA分子，存在于细胞质中，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，是闭合环状的双链DNA分子。质粒不是细菌生长繁殖所必需的物质，可自行丢失或人工处理而消除，如高温、紫外线等。质粒携带的
质粒是什么
质粒(Plasmid)质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子。在基因工程中
什么是质粒
染色体以外能自我复制的遗传因子。不具有胞外期，对寄主细胞来说是非必需的。质粒可能是DNA或RNA。质粒DNA不仅存在于细菌、蓝藻等原核生物中、在酵母、丝状真菌、植物、动物和人类等真核细胞中也有发现。除少数已鉴定出它们所编码的遗传性状以外，大多数是功能尚未清楚的隐蔽质粒。RNA质粒包括独立于寄主细胞染
质粒是什么
质粒(Plasmid)质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子。在基因工程中
质粒如何提取
需要掌握技能1. 质粒转化具体操作步骤： 将1ul 质粒DNA加入1.5ml的离心管； 将感受态细菌（competent cells）从－70℃冰柜中取出，快速吸取50ul感受态细菌，加入含质粒DNA的1.5ml的离心管； 轻轻地旋转以混匀内容物，在冰中放置30～60 min； 42度热休克
质粒提取（二）
2)加200μl新配制的溶液Ⅱ。溶液Ⅱ0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)1%SDS盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。3)加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ溶液Ⅲ5mol/L乙酸钾 60ml冰乙
质粒的制备
构建载体 实验方法原理 在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状
提质粒步骤
质粒提取主要包括三个步骤：1、菌体扩繁。2、菌体裂解释放质粒DNA。3、质粒DNA的分离与纯化。质粒提取办法中，最常用的是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特色。其原理是：强碱（pH12.0-12.6）环境下，SDS损坏细胞壁并裂解细胞，一同使宿主细胞的蛋白质、染色体及DNA发生变性，
大提质粒原理
大提质粒提取主要有碱裂解法，煮沸裂解法，小量一步提取法等。碱裂解法原理：根据共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学结构差异来分离的。在强碱环境下，细菌的细胞壁和细胞膜被破坏，基因组DNA和质粒DNA被释放出来，线性DNA双螺旋结构被破坏而发生变性。虽然在强碱的条件下共价闭合环状质粒DNA也会发生变性
什么是质粒
染色体以外能自我复制的遗传因子。不具有胞外期，对寄主细胞来说是非必需的。质粒可能是DNA或RNA。质粒DNA不仅存在于细菌、蓝藻等原核生物中、在酵母、丝状真菌、植物、动物和人类等真核细胞中也有发现。除少数已鉴定出它们所编码的遗传性状以外，大多数是功能尚未清楚的隐蔽质粒。RNA质粒包括独立于寄主细胞染
质粒与载体
一、质粒绝大多数的生物都是以DNA 的形式来储藏其遗传信息。遗传物质要能生生不息地传给后代的首要条件就是它至少要具有一个复制原(ori, origin of replication，或译为复制起点)，使整个基因体得以复制。含有复制原的遗传物质称为replicon，我们姑且把它译为为复制体吧！原核性复
质粒转化步骤
质粒的转化，满满干货原理：在受体细胞经过化学试剂或者电击处理等方法处理后，受体细胞的膜通透性发生改变，质粒DNA或者以其为载体的重组DNA分子，进入到细菌体内而实现扩增。感受态细胞：是指细胞自然或者经过诱导处于容易吸收外源DNA的一种生理状态。在基因工程中，用于转化的受体菌（Restriction-
质粒转化步骤
质粒的转化，满满干货原理：在受体细胞经过化学试剂或者电击处理等方法处理后，受体细胞的膜通透性发生改变，质粒DNA或者以其为载体的重组DNA分子，进入到细菌体内而实现扩增。感受态细胞：是指细胞自然或者经过诱导处于容易吸收外源DNA的一种生理状态。在基因工程中，用于转化的受体菌（Restriction-
关于位点特异重组的重组效应简介
位点特异性重组既可以发生在一个DNA分子中，也可以发生在两个DNA分子间。重组酶识别位点有方向性，所以重组时两个重组位点的排列有方向性。 1．插入 当位点特异性重组发生在两个闭环DNA之间或一个闭环DNA与一个线性DNA之间时，重组的结果是DNA插入（即整合），并且插入之后在两端形成同向重复序