目的基因的PCR克隆的原理（一）
1实验原理 1.1聚合酶链式反应（PCR）的基本构成 PCR指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、 DNA测序、分子系统遗传学等。 PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP ......阅读全文
PCR产物克隆
克隆方法：1. 平端连接 通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条DNA链的3''末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3''突出一个碱基的DNA分子。这种DN
基因扩增PCR的扩增与克隆方法介绍
①引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区,且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异性结合,提高反应的特异性 ②引物长度:15-40bp为宜。引物过短或过长均可使反应的特异性下降。 ③引物的碱基尽可能随机发布,避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列,G+C碱基的含量在40%-75%
利用PCR技术获取目的基因的前提是什么
利用PCR技术获取目的基因的前提要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
PCR产物的克隆
PCR 产物的克隆 PCR 产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。 平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的 PCR 产物直接进行连接。载体可用EcoR V 或 Sma I 切成平头； PCR 产物纯化后，可以在 22 ℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶
PCR产物克隆方法
平端连接 通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条 DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由
PCR产物的克隆
PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。 平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求
PCR产物的克隆
PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR 产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR 产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求
PCR技术扩增目的基因中的引物有什么作用
1.与DNA复制中的作用类似，但是在细胞内有其他的酶进行这项工作。在PCR技术中，只加入了四种底物和Taq酶，模板。DNA聚合酶只能在有3‘端时才能复制下去。2.决定扩增片段。扩增目的基因，就要根据目的基因两侧序列设计引物，这样只有目的基因扩增了，得到大量目的基因。这是PCR技术的一项重要应用。
PCR技术（十）：PCR产物克隆方法
平端连接 通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效 率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能 在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为 3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR
PCR电泳目的条带很浅
可以照胶的时候去调节亮度，对比和γ射线，然后会清楚一些。同时，你优化下PCR扩增条件之类的，提高扩增效率。
PCR电泳目的条带很浅
可以照胶的时候去调节亮度，对比和γ射线，然后会清楚一些。同时，你优化下PCR扩增条件之类的，提高扩增效率
基因克隆
外源DNA和质粒载体的连接反应 外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交
PCR技术中为什么3次循环才能得到目的基因
原因如下：1、第一个循环扩增出来的新片段很长很长。2、第二个循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因。3、第三个循环，当以第二个循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，当第三个循
PCR技术中为什么3次循环才能得到目的基因
原因如下：1、第一个循环扩增出来的新片段很长很长。2、第二个循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因。3、第三个循环，当以第二个循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，当第三个循
PCR技术中为什么3次循环才能得到目的基因
原因如下：1、第一个循环扩增出来的新片段很长很长。2、第二个循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因。3、第三个循环，当以第二个循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，当第三个循
qpcr的目的基因cp值太大怎么办
每个样本RNA量都确保取500ng反转吗？如果这些没问题的话，我建议多做几个内参，比如GAPDH/B2M...选做三个内参 再取平均值，得到的数据会可靠些。
PCR技术中为什么3次循环才能得到目的基因
原因如下：1、第一个循环扩增出来的新片段很长很长。2、第二个循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因。3、第三个循环，当以第二个循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，当第三个循
利用pcr技术扩增目的基因，为什么是三次
PCR扩增就是循环步骤，一般进行20-40个循环。每次循环*2（不考虑扩增效率）。你说的三次是什么意思？最多这样（自己看图理解）：至此，就是三个循环，卡住了一个大小区间（比如100bp），接下来 以此不断重复。
PCR技术中为什么3次循环才能得到目的基因
原因如下：1、第一个循环扩增出来的新片段很长很长。2、第二个循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因。3、第三个循环，当以第二个循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，当第三个循
PCR技术中为什么3次循环才能得到目的基因
原因如下：1、第一个循环扩增出来的新片段很长很长。2、第二个循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因。3、第三个循环，当以第二个循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，当第三个循
PCR技术中为什么3次循环才能得到目的基因
原因如下：1、第一个循环扩增出来的新片段很长很长。2、第二个循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因。3、第三个循环，当以第二个循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，当第三个循
PCR技术中为什么3次循环才能得到目的基因
原因如下：1、第一个循环扩增出来的新片段很长很长。2、第二个循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因。3、第三个循环，当以第二个循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，当第三个循
PCR技术中为什么3次循环才能得到目的基因
原因如下：1、第一个循环扩增出来的新片段很长很长。2、第二个循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因。3、第三个循环，当以第二个循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，当第三个循
利用pcr技术扩增目的基因，为什么是三次
PCR扩增就是循环步骤，一般进行20-40个循环。每次循环*2（不考虑扩增效率）。你说的三次是什么意思？最多这样（自己看图理解）：至此，就是三个循环，卡住了一个大小区间（比如100bp），接下来 以此不断重复。
RTPCR中目的基因与内参基因的循环数都大于30
不会。做cDNA的时候样品少，经常会上30的。如果你做了复孔，重复样的Ct值一样就可以。如果你做了梯度，Ct值呈线性的话，就可以，如果是乱七八糟的，就不行了。
PCR产物的TA克隆
TA克隆 系统可以用于快速地、一步到位地把PCR 产物直接插入到质粒载体的多克隆 位点（MCS）中。实验方法原理PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR 产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR 产物纯化后，可以在2
PCR产物的TA克隆
实验原理DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。2. 利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体
PCR产物的TA克隆
实验概要本实验介绍了DNA回收和连接的基本原理，PCR产物的T-vector克隆。实验原理1. DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片
PCR扩增产物的克隆——TA克隆法
实验方法原理TA克隆 系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR 产物的克隆 和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR 产物的3'末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3'T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位
PCR不能扩增出目的条带
建议：1、用引物在ncbi里去查，看看是否完全匹配，国外文献尚有错误，如果是国内的......；2、不是提高退火温度，而是降低，看看是否有非特异性的产物；3、有条件的话，建议找一个阳性对照，质粒最方便。如果没有这个基因的，可以找一个看家基因的，再合成一对引物，做阳性对照。检查整个体系中是否有问题。阳