基因工程的载体和工具酶5
（二）Klenow片段酶Klenow片段是大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为76KD 。酶催活性：⑴5’ →3’ 的聚合酶活性 ⑵3’→5’ 的核酸外切酶活性Klenow片段的主要用途（利用5’ →3’ 的聚合酶活性）：⑴修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端⑵标记DNA片段的末端底物用［α－32P］－dNTPs⑶cDNA克隆中第二链cDNA的合成⑷DNA序列的测定（三）T4 DNA聚合酶T4DNA聚合酶是从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，1.酶催活性：⑴5′→3′的聚合酶活性⑵3 ′→ 5 ′的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I 的活性高200倍。比Klenow 片段酶强100～1,000倍。因此，可以综合利用这两种活性进行取代合成反应：如果反应体系中仅存在一种dNTP或没有底物时，这时T4DNA聚合酶就会表现出3 ′→ 5 ′外切酶活力，从双链DNA的......阅读全文
基因工程的载体和工具酶5
（二）Klenow片段酶Klenow片段是大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为76KD 。酶催活性：⑴5’ →3’ 的聚合酶活性 ⑵3’→5’ 的核酸外切酶活性Klenow片段的主要用途（利用5’ →3’ 的聚合酶活性）：⑴修补限制性酶消化DNA形成的3
基因工程的载体和工具酶4
与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端：cohesive ends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。平 末 端 ：Blunt end在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。同裂酶
基因工程的载体和工具酶3
2.M13噬菌体载体的构建 ⑴ 在IS区内插入LacZ基因 ⑵在标记基因区内组装MCS区段 所以能通过a互补在X-Gal/ IPTG平板上识别重组体。这类载体包括了 M13mp8、9 和 M13mp18 、 19等 这类载体的突出优点在于其既可以提供单链DNA，也可以提供双链的D
基因工程的载体和工具酶2
2、pUC质粒载体1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技术在pBR322基础上构建的。结构：（1）来自于pBR322的Ori（2）氨苄青霉素的抗性基因(ampr)。但核苷酸序列发生了变化（3） LacZ′基因编码β—半乳糖酶的α—肽链即氨基末端。（4）MCS区段是一段用于插入外
基因工程的载体和工具酶1
第一节载体引言基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。作为基因克隆的载体必须具备以下特性：⑴载体必须是复制子。⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。⑶具备多克隆位点（M
基因工程的载体和工具酶应用结合案例
第一节 载体引 言基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。作为基因克隆的载体必须具备以下特性：⑴载体必须是复制子。⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。⑶具备多克隆位点
基因工程常用的工具酶2
①增加限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多。②增加酶反应体系的体积，以使潜在的抑制物被相应的稀释。③延长酶解反应的保温时间。④向反应体系中添加亚精胺（spermidine）（终浓度为1~2.5mmol/L），亚精胺与负电性的杂质结合。注意，亚精胺在4℃时会沉淀DNA，因此最好在反
基因工程常用的工具酶1
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。2．类型：来自原核生物，有三种类型。Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。Ⅱ型：大多能
基因工程操作的各种工具酶都是什么
基因工程操作中涉及一系列相互关联的酶促反应。已经知道有许多重要的核酸酶，如限制性内切核酸酶、外切核酸酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、反转录酶、DNA及RNA的修饰酶等，在基因工程的操作中有着广泛的用途。 1.限制性内切核酸酶 限制性内切核酸酶(restrictionendonuclease)
基因工程的载体2
2、pUC质粒载体 1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技术在pBR322基础上构建的。 结构： （1）来自于pBR322的Ori （2）氨苄青霉素的抗性基因(ampr)。 但核苷酸序列发生
基因工程的载体1
引 言基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。作为基因克隆的载体必须具备以下特性：⑴载体必须是复制子。⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。⑶具备多克隆位点（MCS），
基因工程的载体3
⑷基因组成 lDNA至少包括61个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约1／3为非必须区段。 3. l噬菌体载体的类型 插入型 （Insertion vectors ）
基因工程中主要的工具酶有哪几种
基因工程工具酶主要包括限制酶、聚合酶、连接酶、修饰酶和核酸酶五大类，具体解释如下：1、DNA限制性内切酶生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息；2
基因工程的载体需要具备那些条件
因工程载体是将外源DNA携带进入宿主细胞的工具，一般至少有以下几个条件：1、容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好；2、容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞；3、能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力；4、有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进
理想的基因工程载体须具备哪些功能？
①具有复制起始位点，能使插入的外源目的基因或DNA片段在宿主细胞内进行独立并且稳定的自我复制；②在DNA复制的非必需区具有多种限制酶的单一识别位点，能被各种限制酶所识别并插入外源DNA片段；③具有用来筛选重组体DNA的选择标记基因；④序列较短，利于容纳较长的外源DNA片段；⑤具有较高的遗传稳定性。为
什么是工具酶呢？工具酶都有哪些？
作为试剂用于测定化合物浓度或酶活力的酶称为工具酶。对于底物或产物不能直接测定或难于准确测定的酶促反应，采用酶耦联法测定。1.NAD（P）十或NAD（P）H偶联的脱氢酶及其指示反应。2.偶联H2O2的工具酶及其指示反应有些酶作用于底物时，可使其氧化产生H2O2，在POD的作用下使色素原氧化显色进行测定
质粒作为基因工程的载体应具备那些条件
目前所用的载体有细菌的质粒(如大肠杆菌质粒)、噬菌体或病毒,更多的是经过人工改造的一些载体.用于分子克隆的载体都应具备下述条件： ① 在细胞内能自主复制,即具有复制原点,可以使所携带的外源DNA在受体细胞内忠实地复制； ② 有适宜的限制酶切位点.最好是对多种限制酶有单一切点,且酶切位点不在复制原点内
关于基因工程表达载体的技术前景介绍
科学界预言，21世纪是一个基因工程世纪。基因工程是在分子水平对生物遗传作人为干预，要认识它，我们先从生物工程谈起：生物工程又称生物技术，是一门应用现代生命科学原理和信息及化工等技术，利用活细胞或其产生的酶来对廉价原材料进行不同程度的加工，提供大量有用产品的综合性工程技术。生物工程的基础是现代生命
pMCS5载体的基本信息和质粒图谱
pMCS5载体载体基本信息载体名称pMCS5载体抗性Ampicillin载体长度3081 bp载体类型Basic Cloning Vectors载体来源MoBiTec拷贝数High copy number5'引物M13 fwd3'引物M13 revpMCS5载体质粒图谱
限制酶在基因工程和基因诊断中的应用
限制酶的上述特性在基因工程和基因诊断中具有重要用途：①首先不论DNA的来源如何，用同一种内切酶切割后产生的粘性末端很容易重新连接，因此很容易将人和细菌或人和质粒任何两个DNA片段连接在一起，即重新组合，这是重组DNA技术的基础。②人类的基因组很大，不切割无法分析其中的基因。限制酶能把基因组在特异的部
pRANGER™BTB5载体的基本信息和质粒图谱
pRANGER™-BTB-5载体载体基本信息载体名称pRANGER™-BTB-5载体抗性Trimethoprim载体长度3161 bp载体类型Basic Cloning Vectors载体来源Lynch MD, Gill RT.拷贝数Medium copy numberpRANGER™-BTB-5载
pGEM®5Zf(+)载体的基本信息和质粒图谱
pGEM®-5Zf(+)载体载体基本信息载体名称pGEM®-5Zf(+)载体抗性Ampicillin载体长度3000 bp载体类型Basic Cloning Vectors载体来源Promega拷贝数High copy number5'引物M13 fwd3'引物M13 revpGEM
几丁质酶用于抗病基因工程
进入20世纪80年代，随着分子生物学的蓬勃发展，使几丁质酶用于生物防治的研究上升到基因工程水平。1984年Shapira把几丁质酶基因从粘质沙雷氏菌（S.marcescens）克隆到E.coli后，被整合的E.coli和酶的提取液，在室温条件下均表现出对真菌的生物防治能力。1988年Phillio
基因工程载体应具备的几个主要特征是什么
对理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求：①能在宿主细胞中复制繁殖，而且要有较高的自主复制能力。②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。每种酶的切位点只有一个。④容易从宿主细胞
pMALc5G载体的基本信息和质粒图谱
pMAL-c5G载体载体基本信息载体名称pMAL-c5G载体抗性Ampicillin载体长度5680 bp载体类型Basic Cloning Vectors载体来源Riggs P.拷贝数High copy numberpMAL-c5G载体质粒图谱
pMALp5G载体的基本信息和质粒图谱
pMAL-p5G载体载体基本信息载体名称pMAL-p5G载体抗性Ampicillin载体长度5755 bp载体类型Basic Cloning Vectors载体来源Riggs P.拷贝数High copy numberpMAL-p5G载体质粒图谱
pMALc5X载体的基本信息和质粒图谱
pMAL-c5X载体载体基本信息载体名称pMAL-c5X载体抗性Ampicillin载体长度5677 bp载体类型Basic Cloning Vectors载体来源Riggs P.拷贝数High copy numberpMAL-c5X载体质粒图谱
pMALp5X载体的基本信息和质粒图谱
pMAL-p5X载体载体基本信息载体名称pMAL-p5X载体抗性Ampicillin载体长度5752 bp载体类型Basic Cloning Vectors载体来源Riggs P.拷贝数High copy numberpMAL-p5X载体质粒图谱
pMALp5E载体的基本信息和质粒图谱
pMAL-p5E载体载体基本信息载体名称pMAL-p5E载体抗性Ampicillin载体长度5755 bp载体类型Basic Cloning Vectors载体来源Riggs P.拷贝数High copy numberpMAL-p5E载体质粒图谱
pMALc5E载体的基本信息和质粒图谱
pMAL-c5E载体载体基本信息载体名称pMAL-c5E载体抗性Ampicillin载体长度5680 bp载体类型Basic Cloning Vectors载体来源Riggs P.拷贝数High copy numberpMAL-c5E载体质粒图谱