分子生物学常用实验技术（三）
第二章DNA 酶切及凝胶电泳第一节概述一. DNA 的限制性内切酶酶切分析 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP 的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA 分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA 的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4 至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在......阅读全文
实验室常用消毒、灭菌技术
一、消毒技术 （一）明确消毒的主要对象 应具体分析引起感染的途径、涉及的媒介物及病原微生物的种类，有针对性地使用消毒剂。 （二）采取适当的消毒方法 根据消毒对象选择简便、有效、不损坏物品、来源丰富、价格适中的消毒方法。 医院诊疗器械按污染后可造成的危害程度和在人体接
实验室常用灭菌技术介绍
灭菌技术(一)高压蒸汽灭菌法的注意事项第一,无菌包不宜过大(小于50cm×30cm×30cm),不宜过紧,各包裹间要有间隙,使蒸汽能对流易渗透到包裹中央。消毒前,打开贮槽或盒的通气孔,有利于蒸汽流通。而且排气时使蒸汽能迅速排出,以保持物品干燥。消毒灭菌完毕,关闭贮槽或盒的通气孔,以保持物品的无菌状态
PCR实验技术（三）
【注意事项】1. PCR引物设计：引物设计可能是PCR扩增成功最关键的因素。如引物设计欠佳，可能导致扩增产物不足，甚至扩增失败，其原因是设计欠佳的引物可导致非特异扩增和/或形成引物二聚体，此又成为PCR反应的竞争性产物，从而进一步抑制PCR产物形成。在引物设计时必须考虑以下几个因素，其中最重要的是引
分子生物学实验室常用仪器保养及使用方法
分子生物学操作中会涉及一系列仪器，使用不当导致实验失败、减少仪器使用寿命或损坏仪器。因此在进行操作前细致地了解各种仪器的使用方法及注意事项，是使后继实验事半功倍的一个必要准备。 一、冷冻离心机 低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生
分子生物学实验室常用仪器保养及使用方法
分子生物学操作中会涉及一系列仪器，使用不当导致实验失败、减少仪器使用寿命或损坏仪器。因此在进行操作前细致地了解各种仪器的使用方法及注意事项，是使后继实验事半功倍的一个必要准备。 一、冷冻离心机 低温分离技术是分子生物学研究中*的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及
分子生物学实验室常用仪器保养及使用方法
分子生物学操作中会涉及一系列仪器，使用不当导致实验失败、减少仪器使用寿命或损坏仪器。因此在进行操作前细致地了解各种仪器的使用方法及注意事项，是使后继实验事半功倍的一个必要准备。 一、冷冻离心机 低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生
分子生物学常用试剂的配制
1．LB(Luria-Bertani)培养液、平板的配制 配制每升LB培养液，应在950ml去离子水中加入： 细菌培养用酵母提取物（bacto-yeastextract） 5g 细菌培养用胰化蛋白胨（bacto-tryptone）10g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用5mo
分子生物学常用试剂的配制
1．LB(Luria-Bertani)培养液、平板的配制配制每升LB培养液，应在950ml去离子水中加入：细菌培养用酵母提取物（bacto-yeastextract）5g细菌培养用胰化蛋白胨（bacto-tryptone）10gNaCl10g摇动容器直至溶质完全溶解，用5mol/LNaOH(约0.2
94个各种实验室常用标准（三）
GB/T23621-2009农业植物检疫实验室基础条件 本标准规定了各级农业植物检疫实验室在人员配备、检验用房、设施、环境条件及仪器设备等方面的基础条件要求，本标准适用于各级农业植物检疫实验室建设。 GB19489-2008实验室生物安全通用要求 本标准代替GB19
有机实验室常用仪器装置大全（三）
二、有机实验常用装置为了便于查阅和比较有机化学实验中常见的基本操作，在此集中讨论回流、蒸馏、气体吸收及搅拌等操作的仪器装置。1、回流装置很多有机化学反应需要在反应体系的溶剂或液体反应物的沸点附近进行，这时就要用回流装置(见图2.6)。图2.6(1)是普通加热回流装置；图2.6(2)是防潮加热回流装置
三种常用免疫电泳技术
免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反映的结合产物。这种技术有两大优点，一是加快反应的速度，二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应，以此做更细微的分析。免疫电泳技术的种类有很多，这里仅将常用的技术介绍如下： 一、放射免疫电泳技术 将放射性元素标记的抗体（或抗原）与相应的抗原（或抗体
分子生物学实验室常用仪器使用方法与保养
分子生物学操作中会涉及一系列仪器，使用不当导致实验失败、减少仪器使用寿命或损坏仪器。因此在进行操作前细致地了解各种仪器的使用方法及注意事项，是使后继实验事半功倍的一个必要准备。 冷冻离心机 低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备
分子生物学实验室常用仪器使用方法与保养
冷冻离心机 低温分离技术是分子 生物 学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它 生物 样品的分离制备实验中，都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机已成为分子生物学研究中必需的重要工具。 使用方法： 1.离心机应放置在水平坚固的地板或平台上，并力求使机器处于水平位置以免离心
分子生物学实验室常用仪器使用方法与保养
分子生物学操作中会涉及一系列仪器，使用不当导致实验失败、减少仪器使用寿命或损坏仪器。因此在进行操作前细致地了解各种仪器的使用方法及注意事项，是使后继实验事半功倍的一个必要准备。 一、冷冻离心机 低温分离技术是分子生物学研究中*的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其
生物技术常用实验操作简单介绍
一、总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。1. 提取组织RNA时
生物技术常用实验操作简单介绍
一、总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。1. 提取组织RNA时，
DNA重组实验中常用的技术(一）
一、质粒DNA的提取及鉴定（一）质粒DNA的提取及鉴定 1．收获细菌 （1）将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。 （2）将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4℃以12000g离心5min，将剩余的培养
DNA重组实验中常用的技术（二）
DNA的重组 （一）DNA的酶切与连接 （1）酶切反应 同质粒DNA的鉴定，只不过是质粒DNA换为载体DNA。若大量酶切，则成比例增加。 （2）加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀，-20℃2h以上。 （3）15000rpm离心15min，弃上清。 （4）加
分子生物学常用试剂的配制（一）
1.LB(Luria-Bertani)培养液、平板的配制 配制每升LB培养液，应在950ml去离子水中加入： 细菌培养用酵母提取物(bacto-yeastextract) 5g 细菌培养用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)10g NaCl 10g
分子生物学常用试剂的配制（二）
15.5ml 85%磷酸(1.679g /ml) 40ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0) 使用时再稀释10倍。 Tris-硼酸(TBE)：5×浓贮存液(每升)：54g Tris 碱 27.5g 硼酸20ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)
分子生物学常用贮存液的配制
分子生物学常用贮存液的配制 1、30%丙烯酰胺溶液 【配制方法】将29g丙烯酰胺和1g N,N'-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml.用滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0,置棕色瓶中保存于室温。
实验离心技术进展（三）
转头：突出的改进表现在经计算机计算优化后的轻型转头；碳纤维材料制造的超速和大容量超轻转头；适用于生物大分子（DNA，RNA，蛋白等）离心分离用的小倾角转头（固定倾角 7°~10°）；超高速，特大离心力转头等等。 铝合金制造的轻型大容量转头：以往的6×500ml 角转头自重24kg 以上，经过计算 机
一些分子生物学实验小技术汇编
1．保存菌种保存菌种或长时间放置的培养板应先划板活化菌种，挑取分隔良好的单 克隆接种于2-10 ml ＬＢ中（如菌种含质粒则应加抗生素）３７摄氏度快摇 ８小时，按0.1%-0.5% 比例转种，培养基的量不应超过锥瓶的0.25容量，以 保证足够的通气。用O.D.600 测菌密度时，读数值在0.1-0.
一些分子生物学实验小技术2
5．有关融合蛋白表达载体的克隆 在构建融含蛋白表达载体时除了要注意插入片段的方向、读码框架与载体保持一致外，注意以下问题可能会减少一些不必要的麻烦，当外源片的插入载体起始密码的后面，另一个基因的前面时，注意检查插入后基因的两端是否引入了新的终止密码，特别是用到Klenow mung bean
一些分子生物学实验小技术1
1．保存菌种保存菌种或长时间放置的培养板应先划板活化菌种，挑取分隔良好的单 克隆接种于2-10 ml ＬＢ中（如菌种含质粒则应加抗生素）３７摄氏度快摇 ８小时，按0.1%-0.5% 比例转种，培养基的量不应超过锥瓶的0.25容量，以 保证足够的通气。用O.D.600 测菌密度时，读数值在0.
分子生物学绪论（三）
2 基因组研究的发展 目前分子生物学已经从研究单个基因发展到研究生物整个基因组的结构与功能。1977年Sanger测定了ΦX174-DNA全部5375个核苷酸的序列；1978年fiers等测出SV-40DNA全部5224对碱基序列；80年代λ噬菌体DNA合部48502碱基对的序列全部测出；一些
电泳技术：生物化学实验常用技术3
三．凝胶孔径的调节凝胶孔径、机械性能(弹性)、透明度等在很大程度上取决于Acr和Bis二者的总浓度T%。T%越大，孔径越小，机械强度则增加。凝胶的特性是分子筛效应。在聚合前调节单体的浓度来控制凝胶孔径大小，有利于针对样品分子大小，增加分辨力。为此可以根据分离样品分子大小配制不同孔径的凝胶。一般大孔胶
层析技术:生物化学实验常用技术(3)
一、基本原理 是指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。固定相是凝胶。凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构，凝胶的每个颗粒内部都具有很多细微的小孔，如同筛子一样，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则被排阻于凝胶颗粒之外
层析技术:生物化学实验常用技术(2)
在分配层析中，大多选用多孔物质作为支持物，利用它对极性溶剂的亲和力，吸附某种极性溶剂作为固定相；用另一种非极性溶剂作为流动相。如果把待分离的混合物样品点在多孔支持物上，在层析过程中，非极性溶剂沿支持物流经样品点时，样品中的各种混合物便会按分配系数大小流动相而向前移动。当遇到前方的固定相时，溶于流动相
电泳技术：生物化学实验常用技术2
琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种以琼脂糖凝胶为支持物的凝胶电泳，其分析原理与其它支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，直接参与带电颗粒的分离过程，在电泳中，物质分子通过空隙时会受到阻力，大分子物质在泳动时受到的阻力比小分子大，因此在凝胶电泳中，带电