RTPCR需要多大的细胞量及操作步骤
理论上50个cell就可以，但是实际操作中我只看到过牛人从100个cell里面提出来过（用LCM逮的），自己提弄过1000cell的。没有用kit。不同点是用BCP代替氯仿，并且加糖原助沉淀，具体的好处不是很清楚，但是BCP用量小，而且在cell少的情况下，使用糖原可以尽量的降低误操作。由于细胞的大小，RNA量以及你作用时间的差别，不同细胞在抽提RNA的量不一致，初作RNA提取时一般选择6孔板（或35mm版）做，每孔1.5-2ml，这样你的作用药品不用使用很多，RNA提取的量也有保证。以hela 为例，接种量在50万左右，待细胞长到90%时加药品（加入时间一般以你的作用时长为基点，估计到收集时长满），一般提取RNA作用时间不会太长，几个小时而已，所以细胞应长得接近饱和时加入药品，之后收集细胞，提取RNA步骤就一样了，提取的一孔RNA在10-20ug，这些已足够RT使用，具体提取方法站内有许多，搜索就可以了。......阅读全文
如何提高RTPCR反应体系的灵敏度
如何提高RT-PCR反应体系的灵敏度：1、分离高质量RNA成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂如EDTA或SDS等，以及尽可能减少基因组DNA污染。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的大值。2、使用无RNaseH活性的逆转录酶在逆转
Real－time－PCR－跟RTPCR有什么区别
实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1．内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重
microRNA的实时定量茎环RTPCR技术（四）
图5。对热处理细胞，细胞裂解液和10 miRNA实时定量总RNA进行比较。用阈值循环（CT）来衡量miRNA的表达水平。每PCR扩增约400 HepG2细胞进行了分析。 图6。的TaqMan miRNAmiR-16的分析比较来解决以印迹杂交为基础的分析。总RNA来自小鼠肾，肝，肺，脾和睾丸组织。
提高RTPCR的灵敏度与产物长度
摘要RT－PCR 已经成为研究者确定感兴趣的器官、组织或细胞中mRNA 转录本出现、结构和表达水平的基本方法。RT－PCR的基本步骤包括：首先对样品中出现的所有mRNA 合成一个cDNA拷贝，接着扩增感兴趣的基因。因为两个步骤中使用的反应缓冲液不能兼容，所以这两个步骤（RT 和PCR）通常分别进行。
逆转录RTPCR实验仪器及条件
实验器具的准备：RT-PCR所用的500μl和200μl薄壁EP管、移液器吸嘴最好用进口的，因为进口EP管、移液器吸嘴已经去除了RNasin，也已经灭菌处理过，可以直接用。实验前用干净的镊子夹取出EP管、移液器吸嘴插好备用，注意镊子不要碰到EP管内壁和吸嘴的尖部。如果用国产500μl和200μlEP
microRNA的实时定量茎环RTPCR技术（五）
TaqMan miRNA的检测能力不同，是依据采用let-7a, let-7b, let-7c, let-7d 和let-7e 5个合成miRNA来检测低至一个核苷酸（图7）。每个miRNA的检测对应每个miRNA。相对探测效率是通过计完全匹配和不匹配的目标CT之间的差异，假设完美匹配的效率为1
microRNA的实时定量茎环RTPCR技术（三）
评估RNA分离的需要，我们直接在miRNA的检测中增加了细胞裂解物。相当于直接在7.5毫升逆转录反应中添加2.5-2500细胞。当检测到，在一些细胞中CT值相关R2>0.998）的RT反应至少有三个数量级（图4）。 图3。总RNA输入的阈值循环（CT）值检测8个miRNA的相关性。每RT反应中，小鼠
逆转录PCR(RTPCR)扩增基因特异片段
逆转录PCR(RT-PCR)扩增基因特异片段 一、实验原理RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中R
竞争性－RTPCR:－拷贝数的评估
试剂、试剂盒 双蒸水RT-PCR 缓冲液MMLV 逆转录酶SUPERaseIN Taq DNA 聚合酶总 RNA 随机引物dNTP 混合物 基因特异的正向引物基因特异的反向引物仪器、耗材 PCR 仪 PCR 管实验步骤 第一部分：单链 cDNA 的合成一、材料1. 缓冲液、溶液和试剂去除 RNA 酶
RTPCR的操作难点及注意事项
1.优质RNA的获取 2.特异性引物设计 3.TaqMan探针的设计和荧光标记物选择 4.标准曲线分析 一般，DNA样品的定量标准品为基因组DNA&质粒，RNA样品的定量标准品为Total RNA&cDNA&体外转录RNA。绘制标准曲线的标准品梯度的选择一般为5——6个梯度
线虫总RNA提取及RTPCR实验方法
C. elegans RNA Isolation and RT-PCRReagents Needed:M9 (common stock)Trizol (stored at 4ºC)chloroform2-propanol70% EtOHRNase-free H2OiScript cDNA Synth
提高RTPCR的灵敏度和产物长度
RT－PCR 已经成为研究者确定感兴趣的器官、组织或细胞中mRNA 转录本出现、结构和表达水平的基本方法。RT－PCR的基本步骤包括：首先对样品中出现的所有mRNA 合成一个cDNA拷贝，接着扩增感兴趣的基因。因为两个步骤中使用的反应缓冲液不能兼容，所以这两个步骤（RT 和PCR）通常分别进行。即使
RTPCR需要多大的细胞量及操作步骤
理论上50个cell就可以，但是实际操作中我只看到过牛人从100个cell里面提出来过（用LCM逮的），自己提弄过1000cell的。没有用kit。不同点是用BCP代替氯仿，并且加糖原助沉淀，具体的好处不是很清楚，但是BCP用量小，而且在cell少的情况下，使用糖原可以尽量的降低误操作。由于细胞的大
竞争性－RTPCR:－拷贝数的评估
在预实验中，对样品和竞争子应分别做反转录，然后，不变的这种样品反转录产物的量与竞争子反转录产物 2 的对数倍稀释的量相结合，用于 PCR，这种方法可以确定样品的最适拷贝数。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。试剂、试剂盒双蒸水RT-PCR 缓冲液MMLV 逆转录酶SUPER
RTPCR的引物设计的基本原则
1.上下游引物要保守： 为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行pcr扩增。所以引物的选取也要非常的保守，最好不要有不同的碱基，若不得不有时，也必须保证引物的3’端至少有4个碱基是完全保守才可。 在设计保守引物时，要在发表序列上分别找保守一致的区域，即在发表序
RTPCR内参基因选择：除了βactin还能用什么？
Q1： 要做real-time pcr，而该种的β-actin未确定，我知道一般用持家基因作内参，但似乎其他基因各有缺点，有的作者用他们做内参时被SCI杂志要求用两个内参以证实，我想知道的是除了β-actin，哪个基因是SCI公认的内参基因(不用作两个内参了)?A1： 28S和18S rRNA甘油醛
RTPCR检测汉坦病毒基因及分型
材料： （1）急性期病人血清、鼠肺、鼠血或分离的汉坦病毒（2）引物：引物序列（5’～3’）位置片段（bp）逆转录引物TAGTAGTAGACTCC1~14LMS通用外引物AAAGTAGGTGITAYATCYTIACAATGTGG1910~1939M(+)GTACAICCTGTRCCIACCCC2373
RTPCR常见问题分析及其解决方案
常见问题可能原因建议解决方案少量或没有RT-PCR产物RNA被降解分离无污染，高质量的RNA；提取RNA的材料要尽量新鲜，防止RNA降解；RT反应前，在变性胶上分析RNA的完整性；RNA提取后，应储存在100％甲酰胺中， 如果使用RNase抑制剂，加热时小于45℃；pH小于8.0，否则抑制剂会释放所
microRNA的实时定量茎环RTPCR技术（一）
摘要：已开发出一种新型的microRNA（miRNA）的定量方法，即利用茎环反转录，Taqman PCR分析。茎环RT引物在RT 效率和特异性方面比传统的更好。TaqMan miRNA的检测是很具体的，可以检测成熟miRNA和区分相关的甚至低至一个核苷酸的miRNAs。此外，他们不会受到基因组DNA
实时荧光定量RTPCR的Fold－change怎么计算
3. Real-time qPCR定量方法可以分为绝对定量和相对定量。绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。相对定量可以分为比较Ct
microRNA的实时定量茎环RTPCR技术（二）
图1。上图描述的是TaqMan miRNA的检测原理，基于TaqMan实时定量miRNA的包括两个步骤，茎环RT和实时PCR。茎环RT引物结合在miRNA分子的3'端和用反转录酶逆转录。然后，RT产品使用传统的TaqMan PCR定量，其中包括特定miRNA的正向引物，反向引物和
关于生物学技术—RTPCR技术的基本介绍
关于生物学技术—RT-PCR技术的基本介绍（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作
影响RTPCR的因素和反转录引物的选择
在做qPCR/PCR实验之前，必不可少的一步就是反转录。别小看它哦，它在整个实验流程中发挥着重要作用！反转录（Reverse transcription ）是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase C
RTPCR样孔中有气泡会不会影响结果
多少回影响些，在顶部在底部，气泡大大小小只是影响大小的问题，建议先将管倾斜将气泡轻轻弹至顶部然后直立再轻轻弹试试，实在不行就小转速离心试下。
相对－RTPCR:－引物与竞争子比例的决定实验
这个方案的目的是要选择一个 18SrRNA 引物和竞争子之间的恰当比例，可以模仿目的转录本的表达量。对于大多数转录本来说，一般比例为 3:7。对于模板比较稀少的，采用2:8 或 1:9 可能更恰当。准备的 PCR 反应混合物应比 5 个反应多 10%。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：
RTPCR里的CT值到底代表什么意思
Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值，因此
竞争性－RTPCR:－竞争子－RNA－的构建实验
试剂、试剂盒 乙醇双蒸水DNA 模板[a-32P]ATP仪器、耗材 RT-PCR 竞争子构建试剂盒实验步骤 一、材料1. 缓冲液、溶液和试剂乙醇去除 RNA 酶的双蒸水2. 核酸和寡核苷酸DNA 模板（0.5~1.0ug 线性化的质粒模板或 0.1~0.5ugPCR 模板）3. 放射性复合物[a-3
影响RTPCR的因素和反转录引物的选择
科研党们整天都在为提取RNA而烦恼，费尽九牛二虎之力，终于！RNA质量完美！可是。。。qPCR/PCR结果依然不好，咋整?！在做qPCR/PCR实验之前，必不可少的一步就是反转录。别小看它哦，它在整个实验流程中发挥着重要作用！反转录（Reverse transcription ）是以RNA为模板合成
竞争性－RTPCR:－竞争子－RNA－的构建实验
第一部分：竞争子的设计；第二部分：竞争子RNA的合成、纯化和定量。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。试剂、试剂盒乙醇双蒸水DNA 模板[a-32P]ATP仪器、耗材RT-PCR 竞争子构建试剂盒实验步骤一、材料1. 缓冲液、溶液和试剂乙醇去除 RNA 酶的双蒸水2. 核酸
RTPCR里的CT值到底代表什么意思
Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值，因此