钱其军教授最新文章：DNA改组技术
DNA改组(DNA shuffling)是一种高通量的突变、筛选技术, 自1994年提出以来, 经过了几十年的发展，在DNA、酶和药物蛋白等的改造上都有突出的表现。近期来自第二军医大学，浙江理工大学生命科学学院的研究人员就围绕着这种技术在腺相关病毒定向进化中的发展及其应用，展开了探讨，解析了腺相关病毒AAV衣壳DNA改组方面的研究。 领导这一研究的是第二军医大学东方肝胆外科医院的钱其军教授，钱教授现任东方肝胆外科医院生物治疗科、基因-病毒治疗实验室主任，浙江理工大学生命科学学院新元医药及生物技术所副所长，曾荣获国家杰出青年基金。腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)在基因治疗的诸多载体中备受青睐, 具有显著的优势。迄今为止许多种人类和非人类AAV 血清型被确定, 这些血清型之间的衣壳蛋白VP1, VP2同源性很高, 但VP3的氨基酸序列存在很大差异。 AAV衣壳是AAV ......阅读全文
DNA重组（DNA－recombination）技术：DNA重组的载体2
二、噬菌体载体作为细菌寄生物的噬菌体，大多数具有编码多种蛋白质的基因，能利用宿主细胞的蛋白质合成体系，进行生长和增殖。构建的噬菌体载体，以λ噬菌体、M13和粘粒最为常用。㈠ λ噬菌体载体野生型λDNA是一种基因组为4.8 kb的线性双链DNA，全部序列已知，共编码50多个基因。其中约一半基因参与
DNA重组（DNA－recombination）技术：DNA重组的载体1
载体（vector）是携带靶DNA（目的DNA）片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。常用的载体是通过改造天然的细菌质粒、噬菌体和病毒等构建而成。目前已构建成的载体主要有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等多种类型，亦可根据其用途不同分为克隆载体和表达载体二类。载体的构建和选择应考虑以下
DNA重组（DNA－recombination）技术：DNA重组的载体3
在作为载体时，这些噬菌体有一个很大的优点，即克隆到M13mp载体的外源DNA片段（双链），在子代噬菌体便成为了单链形式。故应用M13mp进行克隆，可方便地分离到大量含有外源DNA某一单链的DNA分子。这种单链DNA可在下列工作中作模板：①主要用作双脱氧链终止法进行DNA序列测定的模板；②制备仅有一条
[运]载体DNA的定义
中文名称[运]载体DNA英文名称carrier DNA定 义在通过转化或转染将外源DNA导入细胞时所用的起辅助作用的DNA。如鲑鱼精子DNA。运载DNA的存在可以增加转化或转染的效率。应用学科生物化学与分子生物学（一级学科），核酸与基因（二级学科）
细胞化学词汇[运]载体DNA
中文名称：[运]载体DNA英文名称：carrier DNA定 义：在通过转化或转染将外源DNA导入细胞时所用的起辅助作用的DNA。如鲑鱼精子DNA。运载DNA的存在可以增加转化或转染的效率。应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科），核酸与基因（二级学科）
T载体克隆的DNA序列分析
实验目的： 了解常规DNA序列分析技术（Sanger双脱氧法）的原理及操作步骤。 实验原理： 在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和Gilbert（1977）发明的化学
分子克隆实验载体DNA的选择
①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松弛型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的
分子克隆化载体DNA的选择介绍
①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松弛型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以
克隆载体的技术要求
①能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。④容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。⑤有容易被识别筛选的标志，当
高容量载体中基因组DNA片段末端的分离(小载体PCR)
实验方法原理 许多真核生物的基因所包含的 DNA，远非单个重组子所能容纳得了的。对于大多数染色体来说，更是如此。因此，必须构建一套重叠的 DNA 克隆，这些克隆的 DNA 按次序排列能形成叠连序列（叠连群），可以涵盖一个很大的基因或目的区域。实验材料 T4 噬菌体 DNA 连接酶限制性内切核酸酶 P
高容量载体中基因组DNA片段末端的分离(小载体PCR)
许多真核生物的基因所包含的 DNA，远非单个重组子所能容纳得了的。对于大多数染色体来说，更是如此。因此，必须构建一套重叠的 DNA 克隆，这些克隆的 DNA 按次序排列能形成叠连序列（叠连群），可以涵盖一个很大的基因或目的区域。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。实验方法原理许多真核生物
高容量载体中基因组DNA片段末端的分离(小载体PCR)
实验方法原理 许多真核生物的基因所包含的 DNA，远非单个重组子所能容纳得了的。对于大多数染色体来说，更是如此。因此，必须构建一套重叠的 DNA 克隆，这些克隆的 DNA 按次序排列能形成叠连序列（叠连群），可以涵盖一个很大的基因或目的区域。
关于DNA重组的基因表达载体的介绍
将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为基因表达运载体， 首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插
分子克隆化DNA片段与载体连接介绍
DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有： ①粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。 ②平头末端连接，用物理方法制备的DN
固定化细胞技术载体要求及常用载体介绍
①载体应是亲水的，疏水载体与有机溶剂相同的变性影响。②载体也是要求有一定的机械强度和稳定性。③常用的载体包括：1、天然高分子（纤维素、琼脂糖、淀粉、葡萄糖凝胶、胶原及其衍生物等）2、合成高聚物（尼龙。多聚氨基酸等）3、无机支持物（多孔玻璃、金属氧化物等）
DNA重组技术(DNA－Recombination)
一、DNA 的酶切与连接（1）酶切反应：同质粒DNA 的鉴定，只不过是质粒DNA 换为载体DNA 。若大量酶切，则成比例增加。（2）加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀，-20℃2h以上。（3）15000rpm离心15min，弃上清。（4）加入75%乙醇洗涤2次，离心弃
应用黏粒载体构建基因组DNA文库
实验方法原理 在 λ 噬菌体中构建基因组 DNA 文库的步骤与在黏粒载体中的步骤基本一致。在这两种系统中，真核 DNA 在体外与载体 DNA 连接，形成能包装到 λ 噬菌体颗粒中的多联体。构建在 λ 噬菌体中的文库以具有感染性的重组噬菌体
外源DNA和质粒载体的连接反应
外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导
外源DNA和质粒载体的连接反应
外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导
应用黏粒载体构建基因组DNA文库
在 λ 噬菌体中构建基因组 DNA 文库的步骤与在黏粒载体中的步骤基本一致。在这两种系统中，真核 DNA 在体外与载体 DNA 连接，形成能包装到 λ 噬菌体颗粒中的多联体。构建在 λ 噬菌体中的文库以具有感染性的重组噬菌体形式贮存和增殖。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。实验方法原理
应用黏粒载体构建基因组DNA文库
实验方法原理 在 λ 噬菌体中构建基因组 DNA 文库的步骤与在黏粒载体中的步骤基本一致。在这两种系统中，真核 DNA 在体外与载体 DNA 连接，形成能包装到 λ 噬菌体颗粒中的多联体。构建在 λ 噬菌体中的文库以具有感染性的重组噬菌体形式贮存和增殖。实验材料 T4 噬菌体 DNA 连接酶牛小肠碱
分子克隆实验DNA片段与载体连接方法介绍
DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头
质粒载体和外源DNA的连接反应
实验原理DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来，该反为需能反应，通常需要加入ATP或NADH，DNA连接酶对粘性末端的连接效率要远高于对平末端的连接效率。在基因基因工程实验中，最常用的来源于T
DNA空载体重组体电泳条带区别
电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型，分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。
用噬菌粒载体制备单链DNA
实验方法原理 噬菌粒巧妙地组合了质粒和丝状噬菌体的特征。除了基本特征外，这些质粒通常是高拷贝数的，并带有一个修饰后的丝状噬菌体的主要基因间区。这个区域 ( 野生型为 508 bp)不表达蛋白，但含有全部的顺式作用序列，该作用是病毒 DNA
用噬菌粒载体制备单链DNA
噬菌粒巧妙地组合了质粒和丝状噬菌体的特征。除了基本特征外，这些质粒通常是高拷贝数的，并带有一个修饰后的丝状噬菌体的主要基因间区。这个区域 ( 野生型为 508 bp)不表达蛋白，但含有全部的顺式作用序列，该作用是病毒 DNA 合成起始和结束及噬菌体颗粒的形态发生必不可少的。本实验来源「分子克隆实验指
用噬菌粒载体制备单链DNA
实验方法原理 噬菌粒巧妙地组合了质粒和丝状噬菌体的特征。除了基本特征外，这些质粒通常是高拷贝数的，并带有一个修饰后的丝状噬菌体的主要基因间区。这个区域 ( 野生型为 508 bp)不表达蛋白，但含有全部的顺式作用序列，该作用是病毒 DNA 合成起始和结束及噬菌体颗粒的形态发生必不可少的。实验材料
质粒载体和外源DNA的连接反应
实验概要掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。实验原理DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来，该反为需能反应，通常需要加入ATP或NADH，DNA连接酶对粘性末端的连接效率要远
siRNA表达载体的技术特点
多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶Ⅲ启动子（pol Ⅲ）中的一种，操纵一段小的发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol Ⅲ启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表
微载体培养的技术特点
●表面积/体积（S/V）大，因此单位体积培养液的细胞产率高； ●把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点； ●可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况； ●简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好； ●培养基利用率较高； ●放大容易； ●细胞收获过程不复杂； ●劳动强