腺相关病毒AAV简介及应用

一、腺相关病毒简介

腺相关病毒（Adreno-Associated Virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成员之一。这一家族成员是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4.7~6kb之间的线状单链DNA基因组。它的复制和增殖依赖于辅助病毒的存在。

作为一种基因导入系统，AAV病毒载体具有安全性好，免疫原性低，能感染分裂细胞和非分裂细胞，能介导基因的长期稳定表达等优点，因此在神经系统的体内和体外研究中，受到越来越多的关注和重视。不同病毒的生物特性比较见图1。

图1 不同病毒的生物学特性比较

纽恩生物常用的AAV血清型有AAV1，2，5，6，7，8，9，rh10等，其中AAV2型是用的最早也是最广泛的类型（见表1），不过因为感染范围较窄，目前已逐渐被其他血清所替代。在这些血清型中，感染体内啮齿类动物神经元效果最好的是AAV8和AAV9型。表1 不同血清型AAV的组织嗜亲性                                                

二、AAV在神经系统中的应用

AAV病毒载体在神经系统的体内应用具有安全、高效和毒性低等优势，非常适用于神经环路的研究。对神经环路的结构、功能和调控机制的研究是当前神经科学领域最活跃的焦点方向之一，它为深入理解神经精神疾病的发病机制，发现新的预防、诊断和治疗手段提供了科学依据。神经环路研究的关键是精确地调控某一神经环路中特定神经元，并且还面临着感兴趣的转基因或Floxed小鼠难以获得，条件性基因敲除小鼠制备过程中的成本高、耗时费力。因此，利用立体定位注射技术将携带特定基因的AAV病毒载体注射到神经系统的特定核团，已成为神经环路研究中被广泛应用的方法。

对于体外培养的神经元，无论是钙转、脂质体转染还是电转，都会有效率低、毒性大、必须对非成熟神经元操作以及导入的基因保持时间短等特点。以往主要用慢病毒（Lentivirus）载体向体外培养的神经元操作以及导入外源基因，但由于慢病毒载体的安全性和不能纯化等缺陷，近年来，越来越多的实验室开始尝试AAV病毒载体感染体外培养的神经元，并发现部分类型的AAV病毒载体可以高效地感染体外培养的各阶段的神经元并且毒性很低。

不管是在神经系统体内还是体外应用，AAV病毒载体既可以导入内源或外源基因的表达，又可以导入某内源基因的RNAi，干扰其表达。或者在Floxed 小鼠神经系统利用AAV病毒载体表达Cre重组酶，实现在病毒感染的细胞中敲除Floxed gene的表达。并且，在要表达的目标基因或RNAi 前面加上神经系统各种特异性的启动子，就可以实现目标基因或RNAi在特异性神经元中的表达。特别在近年来，随着光基因组学的快速发展，越来越多的实验室利用AAV病毒载体向特定神经环路的神经元导入光敏感通道ChR2（Channelrho- dopsin2）、NpHR（Halorhodopsin from Natronomonas pharaonis）等，控制神经元的兴奋或抑制状态，从而研究神经环路的结构、功能和调控机制。

三、AAV应用案例介绍

案例一：AAV介导shRNA定位注射在外侧缰核

结果表明：利用RNA干扰特异性地在外侧缰核降低βCaMKII分子的表达可以逆转天生抑郁大鼠模型的抑郁行为表型。
参考来源：Li K, et al Science 30 August 2013: Vol. 341 no. 6149 pp. 1016-1020  DOI: 10.1126/science.1240729

案例二  rAAV局部注射大脑皮层基因敲减实验

参考来源：Cao et al. Nature Medicine, published online 5 May 2013; doi:10.1038/nm.3162

案例三  rAAV玻璃体腔注射表达光遗传工具

实验结果表明：AAV2/9型对心肌感染能力最强，成年鼠的骨骼肌易感性比幼鼠更强。利用AAV转导GAA（酸性葡糖苷酶）到缺陷型小鼠，ECG检查发现PR缩短。