细菌内毒素检查法标准内毒素的稀释的要求

　　细菌内毒素检查法在药品生产和检测过程中具有重要意义。根据《美国药典》规定，应使用国家参考标准内毒素（RSE），复溶后应旋涡振荡不少于20分钟，并在冰箱中保存不超过14天。再次使用前需要强烈旋涡振荡不少于5分钟，每一步稀释前被稀释液也要旋涡振荡不少于1分钟，不能使用保存的稀释液。此外，美国鲎试剂厂家供应的工作标准内毒素（CSE）在使用说明书中也对内毒素的复溶和稀释有使用旋涡混合器震荡的要求。同样，世界卫生组织及各国药典中的细菌内毒素检查法也对标准内毒素的稀释有震荡混合的要求。

　　为什么对标准内毒素的稀释有如此特殊的要求呢？这与内毒素的化学成分与结构有关。内毒素是具有疏水和亲水双重活性的两性分子，多糖链具有亲水性，而脂肪链具有疏水性。当内毒素溶于水或稀释时，其亲水性糖链朝向水和水接触，而疏水性的脂质链部分却背向水。这导致内毒素的疏水端自然聚集成团，形成直径约为0.1μm的双层壳状或泡囊。脂质A藏于聚集团的内部或贴附于器皿上，而脂质A是激活鲎试剂的主要部分。由于其疏水性，脂质A在水溶液中不能与鲎试剂充分接触，这可能导致检测到的内毒素含量偏低。

　　实验结果表明，同一批号的国家参考标准内毒素在稀释时震荡与否结果相差很大。如果采用旋涡震荡法稀释内毒素，其效价测定的结果与国际参考标准内毒素（IS）基本一致；如果不经振荡稀释，则测定的效价要比国际参考标准内毒素低50%～75%。因此，为了获得准确的效价，内毒素在稀释时必须充分振荡。

在实施1995年版的《中国药典》之前，我国相当部分的鲎试剂在标定灵敏度时并未采用振荡稀释内毒素的方法，这导致标定的灵敏度高于实际值100%～300%。这意味着鲎试剂用户在使用比标示灵敏度高1～3倍的鲎试剂进行细菌内毒素检查。这一现象引起了《美国药典》以及世界卫生组织等机构的关注，并一直强调和推动在药品生产和检测过程中应严格遵守规定，以确保公众的健康安全。

　　总之，根据《美国药典》和其他相关规定，对细菌内毒素检查过程中使用的标准内毒素进行复溶和稀释时，必须遵循特定的程序和要求。这包括使用旋涡振荡器进行充分振荡、在冰箱中保存不超过14天、再次使用前进行强烈旋涡振荡以及每一步稀释前对被稀释液进行旋涡振荡。这些要求是基于对内毒素化学成分和结构的理解而制定的，旨在确保准确检测内毒素含量并保障公众健康安全。