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1. 真核生物表达的优越性和必要性① 真核生物具有转录后加工系统，可识别并删除基因中的内含子，剪切加工为成熟mRNA.②具备完善的翻译后加工系统，可进行糖基化、乙酰化等修饰，使蛋白形成正确的天然构型，因而真核生物表达系统产生的蛋白更接近天然状态，有利于其功能、生物活性的研究。③某些真核细胞可将基因表达产物分泌到细胞培养液中，简化了纯化工艺，降低了生产成本。另外，由于真核生物表达的调控方式非常复杂，有助于我们深入了解基因调控的机制。2. 真核基因组的复杂性与原核生物比较，真核生物的基因组更为复杂，可列举如下。（1）真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在109bp数量级，比细菌大千倍；大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因。（2）真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分(如线粒体DNA等)，这就增加了基因表达调控的层次和复杂性。（3）原核生物的基因组......阅读全文
外源基因在原核细胞中表达是基因工程操作中最初取得成功的途径。1 原核生物基因表达的特点同所有的生命过程一样，外源基因在原核细胞中的表达包括两个主要过程:即 DNA转录成mRNA和 mRNA翻译成蛋白质。与真核细胞相比，原核细胞的表达有以下特点:①原核生物只有一种RNA 聚合酶(真核细胞有三种)识别原
原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。自上世纪70年代基因工程 技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今
核酸分子杂交技术由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的
全球公认的最高效转染技术，针对免疫细胞、神经细胞、干细胞等几乎所有的难转染细胞系或原代细胞，以及悬浮细胞。 ——Amaxa品牌Nucleofector细胞核转染技术 Amaxa®Nucleofector®技术是Lonza(原Amaxa)公司的专利创新技术，它综合应用传统的电穿孔技术及细胞特异性
实验步骤 一、杆状病毒表达载体 最简单的经典杆状病毒表达载体是一个重组的杆状病毒，其基因组含有一段外源核酸序列，通常为编码目标蛋白质的dDNA，在多角体蛋白启动子控制下进行转录。这个嵌合的基因由多角体蛋白启动子和外源蛋白编码序列组成
IS PCR的技术特点 （1）既具有PCR的特异性与高灵敏性，又具有原位杂交的定位准确性；（2）测到低于2个拷贝量的细胞内特定DNA序列，甚至可检测出单一细胞中的仅含一个拷贝的原病毒DNA；（3）有助于细胞内特定核酸序列定位与其形态学变化的结合分析；（4）可用于正常或恶性细胞，感染或非感染细胞的鉴定
不用创建一个胚胎，而将成体细胞还原为胚胎状态是一件棘手的事情。科学家们现已能重置一个成熟体细胞中的DNA，使该细胞能成长为人体内的任何细胞类型，如心脏肌肉细胞、神经细胞和膀胱细胞等。 一个病人到医院诊断病情，医生告知其诊断结果不太好，必须进行手术治疗。 于是，医生从病人的头上拔出一根
（6）遗传标记： 从成千上万个哺乳细胞中，检测出极少数的含DNA重组体的转染细胞，并鉴定已导入外源DNA是哺乳动物细胞基因表达系统的一个关键内容。因此，在真核生物表达载体上必须附有标记基因，才能进行筛选。常用的标记基因有：胸苷激酶基因（thymidine kinase，TK）、二氢叶酸还原酶
[摘要] 目的：建立基因枪子弹制备以及转染体外培养cos-7细胞系的方法，观察基因枪介导真核表达质粒pVax-Dsred-IRES-EGFP在细胞内的表达情况。 方法：亚精氨、氯化钙沉淀法制备子弹，利用原子力显微镜观察子弹制备（DNA+金颗粒）情况；以基因枪的方法分别转染对照组和实
基因枪介导pVax-Dsred-IRES-EGFP质粒转染体外培养细胞系的实验研究 张 亮1 阎瑾琦1马继尧2 王 浩1 刘 宁1 贾锐1 韩 刚2 董金凯2 田仁礼2 于继云[1] 1.军事医学科学院 基础医学研究所，北京 100850； 2.解放军总医院 泌尿外科，北京 1008
自从人类学会蓄养动物、耕作植物以来，我们的祖先就从未停止过对物种的遗传改良。过去的几千年里改良物种的主要方式：针对自然环境造成的突变或无意的人为因素所产生的优良基因和重组个体进行选育和利用，从而通过随机和自然的积累优化基因。然而这种极低几率且无人类控制性的被动模式大大阻碍了农业的发展，迫切地需要
自从人类学会蓄养动物、耕作植物以来，我们的祖先就从未停止过对物种的遗传改良。过去的几千年里改良物种的主要方式：针对自然环境造成的突变或无意的人为因素所产生的优良基因和重组个体进行选育和利用，从而通过随机和自然的积累优化基因。然而这种极低几率且无人类控制性的被动模式大大阻碍了农业的发展，迫切地需要
1.转基因技术的发展 自从人类学会蓄养动物、耕作植物以来，我们的祖先就从未停止过对物种的遗传改良。过去的几千年里改良物种的主要方式：针对自然环境造成的突变或无意的人为因素所产生的优良基因和重组个体进行选育和利用，从而通过随机和自然的积累优化基因。然而这种极低几
专题一：RNA干扰技术（RNAi）1995年，康奈尔大学的Su Guo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义和正义RNA都阻断了基因的表达，他们对这个结果百思不得其解。直到1998年， Andrew Fire的研究证明，在正义RNA也阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA。这些
蛋白表达是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系，通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。 1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性
（1）CaCl2处理以后的转化: 当细菌处于0℃、二价阳离子（如Ca2+、Mg2+等）低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，处于感受态；此时转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，重组DNA在42℃短时间热冲击后吸附在细胞表面，在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原
在作为载体时，这些噬菌体有一个很大的优点，即克隆到M13mp载体的外源DNA片段（双链），在子代噬菌体便成为了单链形式。故应用M13mp进行克隆，可方便地分离到大量含有外源DNA某一单链的DNA分子。这种单链DNA可在下列工作中作模板：①主要用作双脱氧链终止法进行DNA序列测定的模板；②制备仅有一条
蛋白表达是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系，通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同，适合表
2.包涵体的分离与纯化细胞破碎时提取细胞内产物的关键。对于细菌的裂解常用的有酶溶法、超声破碎法、化学渗透法、玻璃珠研磨等。包涵体可通过超声波、匀浆等常规的方法是菌体破碎后，离心就可得到。密度梯度离心后可得到高纯度的包涵体。包涵体一般不溶于水，为了获得可溶性的蛋白质可加入强蛋白质变性剂后使其溶解。一般
基因载体是基因工程的核心，也是基因治疗中强有力的生物工具，我们先来认识和阅读载体图谱吧。 一、载体分类及载体组成元件 载体分类 1、按属性分类：病毒载体和非病毒载体 病毒载体是一种常见的分子生物学工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入目
基因载体是基因工程的核心，也是基因治疗中强有力的生物工具，我们先来认识和阅读载体图谱吧。 一、载体分类及载体组成元件 载体分类 1、按属性分类：病毒载体和非病毒载体 病毒载体是一种常见的分子生物学工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入目的细
应用前景奇妙的克隆克隆技术已展示出广阔的应用前景，概括起来大致有以下四个方面：（1）培育优良畜种和生产实验动物；（2）生产转基因动物；（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；（4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。以下就生产转基因动物和胚胎干细胞作简要说明。克隆山羊转基因动物研究是动
一、目的基因的获得 目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。目前用于获得目的基因的方法有几种，如限制性内切酶直接分离法、文库筛选法、体外扩增法和人工合成法等，其中限制性内切酶法直接分离目的基因和多聚酶链式反应（PCR）或逆转录-
五、亲代杆状病毒基因组的改进就像转移质粒的改进，对亲代杆状病毒基因组的改进也是为了满足各种不同的需要。起初，最主要的目的是找到克服重组杆状病毒载体构建和分离低效率的方法，这也是最初的杆状病毒-昆虫细胞系统存在的主要问题。现在已经知道这个问题的根源在于, 在共转染的昆虫细胞系中，转移质粒和亲代杆状病毒
一、目的基因的获得目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。目前用于获得目的基因的方法有几种，如限制性内切酶直接分离法、文库筛选法、体外扩增法和人工合成法等，其中限制性内切酶法直接分离目的基因和多聚酶链式反应（PCR）或逆转录-多聚酶链式
杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，可用于（1）作为基因工程病毒杀虫剂 ,提高害虫防治效率（2）作为超高效的真核基因表达载体 ,生产有用的工程蛋白（3）研究杆状病毒基因组的结构与功能（4）研究真核基因表达的调控机制。实验方法原理由于昆虫杆状病毒环状双链DNA基因组很大 (约 13
基因治疗（Gene Therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。目前已在癌症、遗传性疾病如地中海贫血，镰刀状贫血症、血友病及先天性黑蒙症等多种疾病中表现出巨大的治疗潜力。基因治疗以其一次给药终身治愈遗传疾病的独特潜力让一切不可能变为有可能。
基因治疗（Gene Therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。目前已在癌症、遗传性疾病如地中海贫血，镰刀状贫血症、血友病及先天性黑蒙症等多种疾病中表现出巨大的治疗潜力。基因治疗以其一次给药终身治愈遗传疾病的独特潜力让一切不可能变为有可能。
通过外源DNA的重组、克隆、以及鉴定，可以获得所需的特异DNA克隆。外源克隆基因在某种表达载体及适宜的宿主细胞中可表达为相应的蛋白质，这就组成了外源基因的蛋白表达系统。表达后的蛋白质必须具有原来的生物学活性，这是基于正确的基因转录、转录后加工、mRNA翻译及翻译后修饰，同时与表达载体的结构和表达体系
在基因表达研究中，研究者比较注意选择合适的表达载体和宿主系统，而往往忽视基因本身是否与载体和宿主系统为最佳匹配这样一个实质性问题。基因的最佳化表达可以通过对基因的重新设计和合成来实现，如消除稀有密码子而利用最佳化密码子，二级结构最小化，调整GC含量等。以下就密码子最佳化、翻译终止效率和真核细胞