方案17原位SDSPAGE肽谱作图方法（Cleveland法）
实验材料含有已分离蛋白质的聚丙烯酰胺平板凝胶试剂、试剂盒化学切割剂考马斯亮蓝含1mol L Tris-Cl 的乙醇聚丙烯酰胺平板凝胶蛋白酶消化缓冲液蛋白酶溶液仪器、耗材白光盒和手术刀聚丙烯试管平板凝胶电泳仪SpeedVac 浓缩器实验步骤方法 1: 酶催化的蛋白质片段化1.固定聚丙烯酰胺凝胶中分离的蛋白质，用考马斯亮蓝染色（5~lOmin)，然后脱色。如果蛋白质条带太浅，重复染色和脱色的步骤，或延长染色时间。2.将凝胶放入透明的盒子中，用手术刀切下蛋白质条带，把条带分别放入聚丙烯试管中。3.用 10 ml 含有 1 mol/L Tris-Cl 的乙醇，浸泡切下来的含有对照蛋白点的凝胶条带，室温 30 min，使凝胶收缩。这一步有助于切下来的胶进入第二块平板胶。如果肽谱作图时着色太浅，应缩短浸泡时间。4.将凝胶带切成碎片，把它们放到第二块平板胶的不同的上样孔中，第二块凝胶应是长的（5 cm) 浓缩胶。用干净的匙引导碎片落到孔的底部......阅读全文
方案17－原位－SDSPAGE－肽谱作图方法（Cleveland法）
实验材料含有已分离蛋白质的聚丙烯酰胺平板凝胶试剂、试剂盒化学切割剂考马斯亮蓝含1mol L Tris-Cl 的乙醇聚丙烯酰胺平板凝胶蛋白酶消化缓冲液蛋白酶溶液仪器、耗材白光盒和手术刀聚丙烯试管平板凝胶电泳仪SpeedVac 浓缩器实验步骤方法 1: 酶催化的蛋白质片段化1.固定聚丙烯酰胺凝胶中分离的
SDSPAGE常用参数
聚丙烯酰胺的特性，包括机械性能，弹性，透明度，孔径大小取决于T，C，T是两个单体(单体丙烯酰胺和N-N’-甲叉双丙烯酰胺)的总百分浓度，C 是与总浓度有关的交联百分比浓度。T=(a+b)/mC=b/(a+b)（a为单体丙烯酰胺的克数，b为N-N’-甲叉双丙烯酰胺的克数，m为缓冲液终体积）a，b的比例
SDSPAGE胶制备
一. 实验原理： SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。 SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样
原位PCR和原位RT
（一）、仪器设备 英国Thermo Hybaid原位PCR仪 。（二）、操作流程1、原位PCR 步骤1）预处理：（1）切片常规脱蜡；（2）0.2mol/L HCl处理10min；（3）5μg/ml蛋白酶K消化组织37℃10min；（4）Nase消化组织37℃ 30min；（5）梯度酒精脱水，室温干燥
SDSPAGE的影响因素
1. 带电颗粒的性质 净电荷多少、颗粒大小及形状。一般净电荷多，直径小而且近于球状，则泳动速度快，反之则慢。 2. 电场强度（电位梯度） 指单位长度（cm）支持物体上的电位降，它对泳动度起着十分重要的作用。一般电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。根据电场强度可将电泳分为低压
Tricine－SDSPAGE实用方案
Tricine-SDS-PAGE是用于分离分子量在1-10kD的肽类用的。一、 试剂配制：1． Low Bis acrylamide（49.5% T, 3% C）Acylamide 48.0gBis 1.5gWater make up to 100ml2. High Bis acrylamide (
SDSPAGE实验方法
试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/l的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰
SDSPAGE胶的干燥
凝胶干燥时遇到的主要问题是凝胶的变形和破裂。将凝胶放在Whatman 3MM滤纸上可防止干燥凝胶变形，但凝胶是否破裂取决于凝胶的厚度和干燥器的质量，因此，应尽量使用薄胶并使凝胶干燥器处于良好状态，使其真空压力波动极少。(1)试剂与配制：固定液：冰醋酸:甲醇:水（10:20:70）(2)电泳后的凝胶用
SDSPAGE的影响因素
1. 带电颗粒的性质净电荷多少、颗粒大小及形状。一般净电荷多，直径小而且近于球状，则泳动速度快，反之则慢。2. 电场强度（电位梯度）指单位长度（cm）支持物体上的电位降，它对泳动度起着十分重要的作用。一般电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。根据电场强度可将电泳分为低压（常压）电泳100—500V，电
SDSPAGE的操作步骤
(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。(主要分为浓缩胶和分离胶，配方可自己上网查下)(2) 样品处理在收集
SDSPAGE的影响因素
1. 带电颗粒的性质净电荷多少、颗粒大小及形状。一般净电荷多，直径小而且近于球状，则泳动速度快，反之则慢。 2. 电场强度（电位梯度）指单位长度（cm）支持物体上的电位降，它对泳动度起着十分重要的作用。一般电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。根据电场强度可将电泳分为低压（常压）电泳100—500V，
SDSPAGE检测蛋白表达
一、材料与仪器30%丙烯酰胺溶液；1.5mol/L Tris-HCl分离胶缓冲液，PH8.8；1.0mol/L Tris-HCl浓缩胶缓冲液，PH6.8；电泳缓冲液，PH8.3；10%SDS溶液；10%过硫酸铵溶液；样品处理液；染色液；脱色液；电泳玻璃板，电泳电源架，电泳槽，电泳仪等；蛋白Mark。
间接原位PCR（原位杂交PCR）
与直接原位PCR所不同的是，靶基因在扩增时不进行标记基团的掺入，而是标记一段与扩增片段互补的探针，在扩增结束后，应用此探针进行原位杂交。因此，此处主要介绍原位杂交，其余方法同原位PCR。一、预杂交1. 试剂与配制2×SSC50%去离子甲酰胺：用4×SSC配制（v/v）预杂交液：2×SSC，5%硫酸葡
间接原位PCR（原位杂交PCR）
间接原位PCR（原位杂交PCR） 实验材料 组织或细胞样品 试剂、试剂盒
间接原位PCR（原位杂交PCR）
与直接原位PCR所不同的是，靶基因在扩增时不进行标记基团的掺入，而是标记一段与扩增片段互补的探针，在扩增结束后，应用此探针进行原位杂交。因此，此处主要介绍原位杂交，其余方法同原位PCR。实验材料组织或细胞样品试剂、试剂盒SSC硫酸葡聚糖甲酰胺脱脂奶粉Denhardt’s 液SDS变性的鲑鱼精DNAR
SDS－PAGE电泳的免疫反应
1、将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。 2、将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面
SDS－PAGE电泳的操作步骤
1、清洗玻璃板一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。2、灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶）。垂直电泳槽（2） 按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可
如何配制sdspage梯度胶
操作步骤（ 1 ）在制板支架上置一专用有机玻璃槽，将固定好的玻璃板下部插入槽内，中部用两个文具夹固定在支架竖板上。在槽内倒入已充分溶化的琼脂，冷凝后封闭胶腔底部。（ 2 ）用直径约 2mm 的聚乙烯管连接好梯度混合器、恒流泵、凝胶模。（ 3 ） 30% 胶液的配制取 50ml 烧杯一只，加凝胶贮液①
SDS－PAGE样品如何处理？
根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方
SDSPAGE梯度胶怎么配置
操作步骤（ 1 ）在制板支架上置一专用有机玻璃槽，将固定好的玻璃板下部插入槽内，中部用两个文具夹固定在支架竖板上。在槽内倒入已充分溶化的琼脂，冷凝后封闭胶腔底部。（ 2 ）用直径约 2mm 的聚乙烯管连接好梯度混合器、恒流泵、凝胶模。（ 3 ） 30% 胶液的配制取 50ml 烧杯一只，加凝胶贮液①
SDS－PAGE电泳的操作步骤
1、清洗玻璃板一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。2、灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶）。垂直电泳槽（2） 按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可
SDSPAGE常见问题分析
1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？ 在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很
SDSPAGE胶的干燥方法
凝胶干燥时遇到的主要问题是凝胶的变形和破裂。将凝胶放在Whatman 3MM滤纸上可防止干燥凝胶变形，但凝胶是否破裂取决于凝胶的厚度和干燥器的质量，因此，应尽量使用薄胶并使凝胶干燥器处于良好状态，使其真空压力波动极少。(1)试剂与配制：固定液：冰醋酸:甲醇:水（10:20:70）(2)电泳后的凝胶用
原位PCR
实验概要原位PCR技术自上世纪90年代初建立至今，科学家就一直对原位PCR的技术和应用进行研究，目前该项技术已日臻完善。原位PCR既能分辨带有靶序列的细胞又能标出靶序列在细胞内的位置，在分子和细胞水平上研究疾病的发病机理、临床过程以及病理的转归，其特异性和敏感性均高于一般PCR技术。在病毒学、病理学
原位PCR
About in situ PCR (Applied Biosystems)Basic information about in situ PCR and its applications.The In Situ PCR: Amplification and Detection in a Cellu
原位杂交与荧光原位杂交
一、原位杂交( In Situ Hybridization,ISH) 是用标记的核酸探针，使用非放射检测系统或放射自显影系统，在组织切片、细胞涂片及染色体制片上等对核酸进行定性、定位和相对定量研究的一种分子生物学方法，具有灵敏、特异、直观等优点。已逐渐成为分子生物学和分子病理学的常见技术之一，广泛
间接原位PCR（原位杂交PCR）实验
实验材料 组织或细胞样品试剂、试剂盒 SSC硫酸葡聚糖甲酰胺脱脂奶粉Denhardt’s 液SDS变性的鲑鱼精DNARnaseDTT乙醇仪器、耗材 玻片石蜡膜橡皮泥湿盒实验步骤 一、预杂交 1. 试剂与配制 2×SSC 50%去离子甲酰胺：用4×SSC配制（v/v） 预杂交液：2×SSC，5%硫
原位杂交与荧光原位杂交
一、原位杂交( In Situ Hybridization,ISH) 是用标记的核酸探针，使用非放射检测系统或放射自显影系统，在组织切片、细胞涂片及染色体制片上等对核酸进行定性、定位和相对定量研究的一种分子生物学方法，具有灵敏、特异、直观等优点。已逐渐成为分子生物学和分子病理学的常见技术之一，广泛
原位杂交与荧光原位杂交
一、原位杂交( In Situ Hybridization,ISH) 是用标记的核酸探针，使用非放射检测系统或放射自显影系统，在组织切片、细胞涂片及染色体制片上等对核酸进行定性、定位和相对定量研究的一种分子生物学方法，具有灵敏、特异、直观等优点。已逐渐成为分子生物学和分子病理学的常见技术之一，广泛应
SDSPAGE的个人经验总结
前些日子做SDSPAGE，做了两天，犯了一大堆错误，写出来供大家借鉴：1。听有人说琼脂粉可以做封底胶，一试，漏了，还是用琼脂糖吧。2 AP用别人旧的，结果胶不干 3 A液，B液用旧的，不干。结论：不要用别人的，一定要自已配，别怕浪费。4 前后Tris 的PH值搞错，结果不凝5 电泳时长板接负极，反了