稳定转染细胞株的构建
1. 2 稳定转染细胞株的构建原理：稳定转染，就是转染的质粒DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因及蛋白。需要在瞬时转染基础上对靶细胞进行筛选或者应用高转染效率的病毒，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物进行细胞传代，从而得到可稳定表达目的基因的细胞系。应用： 观察目的基因及其表达蛋白在某种细胞中的功能（稳定，可长期进行研究）一般流程：1） 筛选浓度测定：以10~14天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度2） 细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%~80%覆盖3） 细胞转染（病毒、脂质体、电穿孔、FuGENE 6）4） 利用质粒上含......阅读全文
稳定转染细胞株的构建
1. 2 稳定转染细胞株的构建原理：稳定转染，就是转染的质粒DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因及蛋白。需要在瞬时转染基础上对靶细胞进行筛选或者应用高转染效率的病毒，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物进行细胞传代，从而得到可稳定表达目的基因的细胞系。应用：
稳定细胞株构建
稳转细胞系（稳定表达细胞株）指在细胞中持续稳定表达特定基因或干扰特定基因表达。稳转细胞株的目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上，使细胞长期稳定表达该基因。稳转细胞株包括多克隆稳转细胞株和单克隆稳转细胞株。慢病毒感染目的细胞后，通过抗性基因筛选得到的细胞株是多个细胞克隆的组合。单克隆细胞株是从多克隆细
筛选稳定表达细胞株转染后多久药物筛选
稳定细胞株筛选是一个长期的过程，稳定细胞株筛选优化，有许多条件需要摸索，而且是从源头开始①在构建载体时，目的基因直接整合到细胞染色体组上，最好不要通过先瞬转在筛选稳定细胞株的这种方法，因为转染效率没有保证②高表达载体的构建，哺乳动物表达量一直是它自身的缺点，最好根据高表达载体定向的驯化细胞，提高蛋白
细胞株是如何构建的？
1，什么是瞬时转染和稳定转染？瞬时转染：外源片段的表达时间短暂。这主要是因为外源导入的裸露的载体整合入基因组的几率非常低，所以以染色体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂而一同复制导致后拷贝数被稀释导致的。而且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极高。这就导致瞬时转染呈现
如何构建耐药细胞株？
肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性是肿瘤治疗失败的重要因素之一，成为目前阻碍肿瘤治疗的绊脚石。因此，探索肿瘤细胞产生耐药的原因以及如何改善肿瘤细胞对化疗药物耐药仍是目前研究的热点和难点。肿瘤细胞耐药的产生是一个复杂的过程，它的机制广泛牵涉到药物代谢学、病理学、生理学等多个学科，这就决定了肿瘤细胞对化疗药物
稳定表达细胞株的建立
1、将转染后的细胞按照一定的比例接种到6孔板中（一般选用1：10和1：100两个梯度），分别采用1200mg/ml，1000mg/ml和800mg/ml的G418进行筛选；以转染携带EGFP质粒载体的细胞作为阳性对照，以未转染质粒载体的细胞作为阴性对照；2、每3～4天换液一次；3、筛选20～30天，
快速构建细胞株的使用策略
细胞株构建是广大做细胞研究科研工作者及生物技术员常用的一种技术，目的就是通过构建一个高产感兴趣蛋白的细胞，而细胞株构建就是实现这个目的的过程。这是一个简单的操作，却也是一个复杂的操作。简单在于，从表面上看，并不需要很高超的操作技巧；复杂在于，这是一个时间周期长、操作步骤多、易污染、易混乱的重复劳动工
稳转细胞株构建原理
稳转株即稳定表达细胞株，指的是基于某一细胞系构建的持续过表达或干扰某特定基因的细胞系。稳定细胞系建立的原理将外源DNA/shRNA克隆到带有某种抗性基因的载体上，重组载体被转染至宿主细胞并整合到其染色体中，并能随细胞分裂稳定传递下去，用载体中所含抗性基因进行筛选。常用的真核表达载体抗性筛选标志物有新
转染细胞的稳定筛选实验
本实验主要用于获得含目的外源基因的真核细胞。实验方法原理外源基因转染真核细胞后整合入基因组DNA，能够长期存在于细胞中，随染色体复制而传给子代。外源基因进入培养细胞一般要经过几天才能够整合入基因组DNA。实验材料转染细胞试剂、试剂盒抗生素培养基胰酶仪器、耗材6孔板24孔板96孔板CO2培养箱滤纸片培
稳定转染的基本概念
一般来说（由细胞类型决定），形成稳定转染细胞的效率比瞬时转染（transient transfection）的效率低1到2个数量级。利用可选择的遗传标记物有利于从非转染细胞的中分离出稀少的稳定转染物。
转染细胞的稳定筛选实验
实验方法原理 外源基因转染真核细胞后整合入基因组DNA，能够长期存在于细胞中，随染色体复制而传给子代。外源基因进入培养细胞一般要经过几天才能够整合入基因组DNA。 实验材料
转染细胞的稳定筛选实验
实验材料 转染细胞试剂、试剂盒 抗生素培养基胰酶仪器、耗材 6孔板24孔板96孔板CO2培养箱滤纸片培养瓶实验步骤 1．确定抗生素作用的最佳浓度：不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性，因此在筛选前要做预试验，确定抗生素对所选择细胞的最低作用浓度。1) 提前24 小时在96 孔板或24 孔板中接种细
电穿孔法稳定转染
实验材料 L8057-Y10细胞 D-PBSA 仪器、耗材 培养瓶 培养板
电穿孔法稳定转染
方案27.12 脂质体介导的瞬时转染 实验材料 L8057-Y10细胞 D-PBSA
电穿孔法稳定转染
实验材料L8057-Y10细胞D-PBSA仪器、耗材培养瓶培养板F12 FB培养基G418(Invitrogen)选择性培养基电穿孔电穿孔专用杯电穿孔仪II电穿孔仪-II配套的效能扩增器-Plus实验步骤表达载体与 DNA 制备：pSVTKGH，线性化 [ Selden et al.，1986]此载
干细胞稳定转染操作步骤
外源基因进入细胞主要有三种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法，实际上其基本原理都是利用不同的方法在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入，但是由于前两者的效率低且伤害较大，所以现在除了对于一些特殊细胞系，一般的转染方法都利用脂质体。利用脂质体转染和其他方法一样，最重要的就是防治其毒性，因此脂质体与
脂质体介导的真核细胞转染实验——脂质体进行稳定转染
实验材料哺乳动物细胞试剂、试剂盒DMEM仪器、耗材培养箱离心管实验步骤1. 接种细胞（见“脂质体介导短暂表达”步骤1）长至50%汇片。 2. 制备DNA/脂质体混合物，转染细胞（见“脂质体介导短暂表达”步骤2和3）。3. 每孔细胞加入1 ml DMEM-20完全培养液，37℃ 培养箱培养48
CHO细胞的稳定转染与基因表达
1、pcDNA3.1＋-gD的线性化: pcDNA3.1＋使用说明书推荐了以下几个酶作为线性化酶(BglⅡ MfeⅡ Bst1107Ⅰ Eam1105Ⅰ PvuⅠ ScaⅠ SspⅠ),通过DNAMAN分析gD序列发现其带有MfeⅡ酶切位点。2、转染前一天,在60mm的dish中接种8×105个细胞
更换细胞系之后需要重新验证敲低效率吗
基因敲出质粒转染可以构建稳定细胞株一种是脂质体转染后,单克隆筛选稳定细胞株.另外一种是应用逆转录病毒,慢病毒转染,筛选稳定细胞株.脂质体转染：在转染24小时后,消化细胞并计数.将细胞种到96孔板,保证每个孔2-3个细胞,这样才能得到单克隆.待细胞贴壁后,加入抗生素筛选.筛选时间和浓度视细胞而定.一般
稳定转染细胞时，质粒总是丢失
稳定转染的细胞株，就是转染后质粒可以稳定整合到基因组上不会因细胞分裂而丢失。区别于质粒瞬时转染不能长时间保留质粒在细胞里。
哪些情况需要使用稳定细胞系
稳定细胞系是指将外源基因整合到宿主细胞基因组中，使外源基因能够在宿主细胞中长期稳定表达，这样的细胞系称为稳定细胞系。其原理是将外源基因克隆到具有某种抗性的载体上，通过转染宿主细胞，外源基因整合到宿主染色体上，用载体中所含抗性基因进行筛选即可得到成功整合目的基因的细胞。在试验过程中，常用的真核表达载
用EBV转染淋巴细胞建立永生化细胞株的方法
一、 试剂1、 淋巴细胞分离液：避光4度保存，用前在37度水浴中加温。整个分离过程中，温度应控制在8-28度，温度过高或过低均影响分离质量。2、 全培养基（用前配置）：RPM1640培养基，内含20%胎牛血清（Gibco）{56℃灭活30分钟}，1.6-1.8% 1M的HEPES，1.2% 0.2m
哺乳动物细胞基因稳定转染的实验
基本方案 实验材料 哺乳动物细胞 试剂、试剂盒
哺乳动物细胞基因稳定转染的实验
分析基因的功能常需要形成含有稳定整合了该基因的哺乳动物细胞系。在转染中大约有1/104细胞将稳定整合外源因而可用一显性（正向）选择标记来分离稳定的转化细胞。用可高效转染的细胞系来确保转染成功。另外，应包括合适的对照以确定目的基因无细胞毒性。实验材料哺乳动物细胞试剂、试剂盒完全培养液仪器、耗材培养箱离
哺乳动物细胞基因稳定转染的实验
实验材料 哺乳动物细胞试剂、试剂盒 完全培养液仪器、耗材 培养箱离心管实验步骤 1. 确定所要转染的细抱系能呈独立集落生长。对于贴壁细胞，在10 cm 组织培养培养皿中接种约100个细胞，培养10~12天，毎4天换液1次。亚甲蓝染色后对成活的细胞集落进行计数。 2. 确定母代细胞的选择条件：将一
G418筛选慢病毒感染稳定细胞株
用慢病毒筛选稳定细胞株，以G418筛选方法为例，筛选出稳定整合Neomycin抗性基因的细胞系。A、 G418抗生素最优浓度筛选 每种细胞对抗生素的敏感性不同，因此，准备建立稳定细胞系之前，需要确定能够在10-14天杀死细胞的最佳浓度。方法如下：1、将细胞稀释到1000个细胞/mL，接种到24孔板，
转染过程中载体蛋白对于目的蛋白是否有影响
转染后Western检测不到高表达量的目的蛋白有很多原因首先就是抗体是否合适需检测的目的蛋白，可以考虑更换其他抗体然后转染可以是瞬时转染，也可以是稳定细胞株转染假如是瞬时转染检测不到，可能就是抗体或者Western操作的问题假如是稳定细胞株转染检测不到，可能是目的基因没有稳定整合到基因组中，或者插入
稳定株构建不出来怎么办？
下面两种情况，常规的稳定株构建式比较困难的，但是办法总比困难多！1）过表达：看基因功能。如果是抑制肿瘤细胞的增殖或促进肿瘤细胞的凋亡，那么是很难构建稳定株的（目的基因感染细胞后就会凋亡或不长）。2）干扰：建议构建可诱导表达的稳定株。RNA 干扰敲减的是细胞内源在用的基因，敲减后，短时间内会看到抑制效
关于慢病毒的相关实验介绍
一、实验目的 对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。 二、实验流程 1. 根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体； 2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的
如何在构建敲除细胞株时利用好CRISPR/Cas9技术？
从 2013 年 1 月份开始到现在，近 2 年的时间里，CRISPR/Cas9 技术的应用领域被来自全球优秀的科学家们不断的扩大。其中包括基因敲除，定点突变，定点整合，基因沉默，基因定位和 CHIP 等多个领域，而且这个技术的应用领域还在不断的被扩大。吉锐生物基于多年的基因重组经验（系统的研究过