PCR技术（二）：PCR反应模板的制备
PCR反应的关键因素主要有引物的选择与设计，酶的质量.模板的制备，在前二者都稳定可行的情况下，PCR模板的制备尤为重要.模板处理方法的选择及操作人员的基 本技能，决定分离模板核酸(DNA或RNA)的质和量及PCR的成败.而提高模板核酸质量的 关键是除去杂质(蛋白质、酶、脂肪等).除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子，提高 模板核酸的产量. 传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏细胞组份，溶解细胞膜， 使蛋白质变性，再用蛋白酶K来消化去除蛋白质，尤其是与DNA结合的蛋白质，再用 酚:氯仿抽提，然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸，供PCR实验用.但近几年来也发展了些 简便实用较为有效的标本消化处理方法.亦可满足PCR实验的要求.采用哪种方法消化 处理标本，视PCR实验的目的(是科研还是检测)及环境条件而定.模板核酸的提取制备方法 (一)蛋白酶K消化裂解法：适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳.如组 织细胞(包括石......阅读全文
PCR技术（二）：PCR反应模板的制备
PCR反应的关键因素主要有引物的选择与设计，酶的质量.模板的制备，在前二者都稳定可行的情况下，PCR模板的制备尤为重要.模板处理方法的选择及操作人员的基 本技能，决定分离模板核酸(DNA或RNA)的质和量及PCR的成败.而提高模板核酸质量的 关键是除去杂质(蛋白质、酶、脂肪等).除去抑制Taq DN
PCR的模板制备
PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。 模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。 标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难
用于－PCR－的模板－DNA－制备实验
酚-氯仿法提取石蜡组织中 DNA 改进的石蜡切片 DNA 提取方法 直接法（DNA 免提法） 冰冻片 含血标本 胸腹水或尿液
用于－PCR－的模板－DNA－制备实验
实验方法原理 实验步骤 1. 10 mm 厚石蜡切片 10～15 张，置入消毒后的 1.5 ml Eppendorf 管中。2. 脱蜡 二甲苯 1200 μl，9000 r/min，8 min×3。3. 脱水无水乙醇 1200 μl，9000 r/min，5 min×3。4. 打开 Eppendor
聚合酶链式反应（PCR）模板的制备
模板的制备PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以
用于－PCR－的模板－DNA－制备实验——冰冻片
实验步骤1. 将 10 μl 冰冻切片直接放入含组织裂解液的离心管中。2. 无菌尖头刀片刮下，放入 300～900 μl 组织裂解液中，并加入 20 mg/ml 蛋白酶 K（PK）10～15 μl，封口膜封口，置 55℃ 3 h 以上。3. 其间用指轻弹离心管以利裂解。若有沉淀，再加入 5～10 μ
用于－PCR－的模板－DNA－制备实验——含血标本
实验步骤1. 3 ml 外周血或 1 ml 骨髓液放入含 50 μl 0.5mol/L EDTA 的无菌离心管（15 ml 管）中。2. 2000 r/min 离心 10 min。吸去血浆，用指弹匀剩余的有核细胞和红细胞，加入红细胞溶解液 10 ml 并混匀，常温下放置 30 min。红细胞溶解液配
高通量的PCR模板植物基因组DNA制备方法（二）
1.2 植物材料 1.2.1 水稻秧苗。将1.6-mL 96方孔板底部用6 mm电钻头打穿，或将旧96孔PCR板的底部剪去约4 mm。使用时将方孔板压入少量泥巴。每孔放入1粒萌动的水稻种子，在自然日光下(或人工气候箱)生长至3~4片叶。其他植物小苗也可用类似方法种植。 1.2.2 水稻大植株的鲜
PCR技术要素模板(靶基因)核酸
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是: 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀; 蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别
用于－PCR－的模板－DNA－制备实验——胸腹水或尿液
实验步骤1. 标本 10 ml 以上，2000 r/min 离心 10 分钟，倒去上清液。用指弹匀沉淀物，加入适量组织裂解液，37℃ 下放置半小时以上。2. 无菌尖头刀片刮下，放入 300～900 μl 组织裂解液中，并加入 20 mg/ml 蛋白酶 K（PK）10～15 μl，封口膜封口，置 55
PCR的模板最大是多少
长片段PCR扩增试剂盒所用的酶是Taq聚合酶和有校正功能的聚合酶的混合酶,这种混合酶可以染色体和其它细胞器的DNA为模板高效进行PCR反应。在人的染色体上可以扩增出27kb的DNA片段,而以DNA为模板则可以扩增出40 kb的片段.现在的那些试剂盒还是比较牛的
用于PCR的模板DNA制备实验——直接法（DNA－免提法）
实验步骤1. 标本太少时，可将一张石蜡切片经脱蜡，水化，蒸馏水清洗，无菌蒸馏水浸泡，取出晾至半干。2. 加入 20～80 μl 直接裂解液中，加 20 mg/ml 蛋白酶 K 0.2～1 μl，放置 55℃ 裂解 3 h 以上；100℃10 min 灭活蛋白酶 K；10000 r/min 离心 10
PCR实验技术指南之PCR反应参数
1. 变性：在*轮循环前，在94℃下变性5-10min 非常重要，它可使模板DNA 完全解链，然后加入Taq DNA聚合酶(hot start)，这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全，往往使PCR 失败，因为未变性完全的DNA 双链会很快复性
PCR实验技术指南之PCR反应参数
1. 变性：在*轮循环前，在94℃下变性5-10min 非常重要，它可使模板DNA 完全解链，然后加入Taq DNA聚合酶(hot start)，这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全，往往使PCR 失败，因为未变性完全的DNA 双链会很快复性
PCR技术反应的控制
①PCR反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子②镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L ③底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L ④TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul） ⑤引物 浓度一般为0.1 ～ 0.5umol/L ⑥反应温度和循
PCR反应技术的特点
1、特异性强决定 PCR 反应特异性的因素有:①引物与模板 DNA 特异分子的正确结合;②碱基配对原则;③ Taq DNA 聚合酶合成反应的忠实性;④靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键,它取决于所设计引物的特异性及退火温度。在引物确定的条件下,PCR 退火温度越高,扩增的特异性越
PCR实验技术（二）
【方法】方法一、基本的PCR方法下面介绍的基本PCR方法可作为任何PCR扩增的一般指导和出发点。由于各种PCR反应条件（如PCR扩增次数、温度、Taq DNA聚合酶的浓度、引物、氯化镁以及模板DNA）变异极大，应根据具体情况，对各种PCR反应条件进行相应调整。1．按以下次序，将各成分加入0.2 ml
直接PCR技术，让PCR更简单（二）
直接PCR（Direct PCR）是一种不经核酸提取而直接使用动物或植物组织等直接进行扩增的反应。在许多方面，直接PCR的工作方式类似于常规PCR。主要区别是直接PCR中使用的定制缓冲液，样本可不经过核酸抽提，直接进行PCR反应，但对于参与直接PCR反应的酶的耐受性和buffer的兼容性有相对应的要
PCR反应技术的反应基本步骤
PCR 全过程包括三个基本步骤,即双链 DNA 模板加热变性成单链(变性);在低温下引物与单链DNA互补配对(退火);在适宜温度下 Taq DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板,利用4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)催化引物引导的 DNA 合成(延伸)。这三个基本步骤构成的循环重复进行,可使特异性 DN
高GC比模板的PCR扩增
PCR条件的优化是一个麻烦耗时的过程，涉及到温度、时间、镁离子、引物、dNTP、Taq酶、模板等多个因素的调整。一般来说利用热启动，比如Platinum Taq DNA聚合酶（Invitrogen）可以达到更高的特异性，降低对镁离子浓度的依赖，并且有利于提高“问题模板”的产量。然而，传统的PCR条件
高GC比模板的PCR扩增
PCR条件的优化是一个麻烦耗时的过程，涉及到温度、时间、镁离子、引物、dNTP、Taq酶、模板等多个因素的调整。一般来说利用热启动，比如Platinum Taq DNA聚合酶（Invitrogen）可以达到更高的特异性，降低对镁离子浓度的依赖，并且有利于提高“问题模板”的产量。然而，传统的PCR条件
高GC比模板的PCR扩增
PCR条件的优化是一个麻烦耗时的过程，涉及到温度、时间、镁离子、引物、dNTP、Taq酶、模板等多个因素的调整。一般来说利用热启动，比如Platinum Taq DNA聚合酶（Invitrogen）可以达到更高的特异性，降低对镁离子浓度的依赖，并且有利于提高“问题模板”的产量。然而，传统的PCR条件
PCR基因芯片上荧光PCR反应的研究（二）
1.3.2 PCR-SSCP方法分析按照我室常规进行。 1.3.3 Taqman荧光探针 以发现的ALAS2基因第五外显子点突变为中心设计，序列如下： 5’ （荧光集团）FAM-CAAGATCATAGAGAAGAAAC- TAMRA（淬灭集团） 3’，设计Taqman荧光PCR反应的上下
高通量的PCR模板植物基因组DNA制备方法（四）
2.3 高通量的分子标记检测 本方法制备的DNA浓度虽然低，用96针复制器加入0.5~1 µL模板进行33~35个PCR循环就可获得足够浓度的产物，并不需要加入特别多的Taq酶(甚至使用量为每45~50 µL PCR反应液1 U也能扩增分子标记)。该方法已对数万份水稻样品进行了分子标记(S
高通量的PCR模板植物基因组DNA制备方法（一）
摘 要：制备大量生物样品的模板DNA用于PCR检测是费时费人工的工作。本文介绍一种高通量的植物基因组DNA(gDNA)快速制备及其用于PCR基因型检测的操作方法。将一小段单子叶植物苗叶片(长度约30 mm或40 mm，与96方孔板的孔深大致相同) 或一小块(约2~4 mg)双子叶植物叶片放入9
高通量的PCR模板植物基因组DNA制备方法（三）
将纯化定量的水稻品种(93-11)基因组DNA标准样品(0.5~8 ng)与1.0 µL本方法制备的水稻品种(02428)基因组DNA混合作为模板，用InDel 标记引物(表1)进行PCR扩增和PAGE检测。箭头指某反应(或2个反应之间)其02428与93-11条带的信号值大致相等(即DNA
PCR技术基本反应步骤
ＰＣＲ是Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（聚合酶链式反应）的首字母缩写，简单说来，ＰＣＲ是由高温变性—低温退火—中温延伸三个基本反应步骤构成：０１ ＤＮＡ的变性成为单链模板ＤＮＡ经加热至９５℃左右一定时间后，使模板ＤＮＡ双链解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；０２低温
PCR反应体系和条件(二)
PCR反应条件的选择 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA
PCR技术的反应特点介绍
特异性强 PCR反应的特异性决定因素为： ①引物与模板DNA特异正确的结合； ②碱基配对原则； ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； ④靶基因的特异性与保守性。 其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDN
PCR技术反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置: 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90～95℃变性,再迅速冷却至40 ～60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模