shRNA干扰载体构建
产品技术背景pRI系列载体是基于III类RNA聚合酶启动子：人类H1启动子的专用于哺乳动物细胞RNA干扰的载体。H1启动子在哺乳动物细胞内合成类似siRNA分子的小分子RNA。由于H1启动子有精确的转录起始位点和终止信号，H1启动子转录产物精确生成人工设计的shRNA，shRNA经过RISC剪切后形成有2个U突出末端的成熟siRNA。由于H1启动子对转录产物长度的严格限制，基本上杜绝了非特异性干扰片段的产生，将载体转染细胞后对其它基因的影响降到最低。pRI系列载体已经成功用于多种哺乳动物细胞进行基因的RNA干扰。本系列中含有新霉素抗性基因的载体用于稳定表达siRNA，可以在更长时间内对基因表达抑制后的细胞功能和生理现象进行观察和分析。 插入寡核苷酸设计pRI系列载体的使用需要将人工设计的寡核苷酸片段插入pRI系列载体中特定的酶切位点之间，寡核苷酸片段中包含了针对目标基因的mRNA设计的长度为19nt的干扰片段。合成时需......阅读全文
shrna引物退火原理
1. 载体取2-5ug，在25ul体系中，用2.5ul的酶切30min-1h，回收载体：载体:---2ul（2-5ug）酶---------2.5ulBuf--------2.5ul水---------18ul回收的时候希望浓度高点。2. Oligo退火形成双链若为2OD=5.4nmol的话，则每个
关于腺病毒包装技术的简介
腺病毒表达系统中的难点主要在于怎么将外源基因表达框或者外源的shRNA表达框构建至腺病毒骨架载体上。由于腺病毒骨架载体比较大（~30kb），而且载体中的一些常用酶切位点几乎都有多个，如果用常规的酶切-连接的方式将外源基因或者shRNA表达框构建至腺病毒骨架载体上，成功率很低，因此，腺病毒表达系统
RNAi实验原理与方法选择（二）
尽管有些公司推出了shRNA和siRNA试剂盒，但这些试剂盒大都突出操作简单，毕竟涉及RNA操作，用户自己难免会产生很多预料不到的困难，晶赛公司可以完全为您解决后顾之忧，您可以直接拿到有效的siRNA或shRNA序列。 3． Dicer酶法生产siRNA优点：可以跳过筛选与检测有效siRNA序列的步
LSCM荧光表达载体的选择和构建
荧光表达载体的选择和构建当对目的蛋白的功能或定位情况了解较少的情况下，可以尝试把荧光蛋白位于目的蛋白的 N 末端或 C 末端。但当目的蛋白上已经存在定位信号或末端存在修饰，需要把荧光蛋白插入到目的蛋白理想的位置，这样可以避免荧光蛋白的插入对蛋白功能或定位产生影响。由于绿色荧光蛋白存在缺陷，因此 GF
构建复制缺陷型疱疹单纯病毒载体实验
基本方案1 构建 HSV-1 IE基因补足型细胞系 基本方案2 构建有复制缺陷的载体 基本方案3 将外源基因序列插入到复制缺陷性基因组人类单纯疱疹病毒（HSV)载 体
LSCM绿色荧光融合蛋白表达载体的构建
绿色荧光融合蛋白表达载体的构建 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP) 及其突变体能在各种不同的生物系统中表达，这对细胞生物学的研究具有重要意义。而荧光蛋白的折叠能力及其同细胞内蛋白的融合能力，使研究 者能直接在细胞体内观察到蛋白质的特性。研究者不需要把蛋白质经过
质粒克隆载体的设计和构建的原则
①选择合适的出发质粒出发质粒也叫亲本质粒，它应含有质粒克隆载体必备的元件，如复制起始位点、选择标记基因、克隆位点、启动子和终止子等。②正确获得构建质粒克隆载体的元件一般采用限制性核酸内切酶切割出质粒DNA分子，获得含有某种元件的DNA片段，还可以采用PCR技术从靶DNA中扩增出含某种元件的特异性DN
：六大病毒载体技术的比较；不同基因传递方法的比较
病毒载体 经典的病毒载体主要有四类，腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒和慢病毒。他们具备侵染细胞谱广，效率高等特点并广为研究人员熟知。它们的特点总结归纳如表一。 表一：六大病毒载体技术的比较 载体 感染广谱性 靶细胞类型 表达形式 表达时间 免疫原
RANi（RNA干扰）术语表
RNA干扰是最近发现的一种功能工具。当RNA导入一个细胞时，最终会引起细胞内互补mRNA的降解，从而导致基因功能活性的阻断。PTGS转录后基因沉默（posttranscriptionalgenesilencing）；一种首先在植物中确定，然后发现在动物中也存在的现象。尽管PTGS最初被描述作一种病毒
RANi术语表
RNAi RNA干扰是最近发现的一种功能工具。当RNA导入一个细胞时，最终会引起细胞内互补mRNA的降解，从而导致基因功能活性的阻断。PTGS 转录后基因沉默（post transcriptional gene silencing）；一种首先在植物中确定，然后发现在动物中也存在的现象。尽管PTGS最
The－TRC－shRNA－Design－Methods－and－Rules
OverviewWe design shRNA molecules with an algorithm. Our algorithm uses several criteria to rank potential 21mer targets within each human and mouse R
体内表达shRNA的设计
1.克隆到shRNA 表达载体中的shRNA 包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA 聚合酶Ⅲ的转录终止子。2.两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。3.Stratagene发现29个寡核苷酸较之原先推荐的
如何阅读基因载体图谱？（三）
三、改造载体 1、改造启动子：一般在过表达载体中CMV属于广谱型的强启动子，具体可根据实验需求，选用不同启动子，尤其是对于AAV载体构建时选用组织特异性启动子。 启动子名称启动子大小组织特异性ALB2.4kb肝脏特异性CAG944bp广泛表达的强启动子CamKIIa1.2kb大脑皮层和海马神经元特异
构建复制缺陷型疱疹单纯病毒载体实验（二）
基本方案2 构建有复制缺陷的载体 实验材料 IE基因-补体细胞系 试剂、试剂盒 胰蛋白酶 EDTA完全的改良的eagle培养基插入带有报告暗盒的质粒限制性内切核酸酶病毒DNA2 X HEPES 缓冲液CaCl2甘油PBS提取 DNA 的缓冲液10 X PCR 扩增缓冲液
构建复制缺陷型疱疹单纯病毒载体实验（三）
基本方案3 将外源基因序列插入到复制缺陷性基因组人类单纯疱疹病毒（HSV)载 体实验材料IE 基因补充细胞复制缺陷性 HSV 载体带外源基因的质粒在24孔板中单层培养IE基因补充细胞系试剂、试剂盒完全改良的基础培养基三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水DNA 抽提缓冲液苯酚 氯仿 异戊醇氯仿异丙醇乙醇总 RNA
应用黏粒载体构建基因组DNA文库
实验方法原理 在 λ 噬菌体中构建基因组 DNA 文库的步骤与在黏粒载体中的步骤基本一致。在这两种系统中，真核 DNA 在体外与载体 DNA 连接，形成能包装到 λ 噬菌体颗粒中的多联体。构建在 λ 噬菌体中的文库以具有感染性的重组噬菌体形式贮存和增殖。实验材料 T4 噬菌体 DNA 连接酶牛小肠碱
应用黏粒载体构建基因组DNA文库
在 λ 噬菌体中构建基因组 DNA 文库的步骤与在黏粒载体中的步骤基本一致。在这两种系统中，真核 DNA 在体外与载体 DNA 连接，形成能包装到 λ 噬菌体颗粒中的多联体。构建在 λ 噬菌体中的文库以具有感染性的重组噬菌体形式贮存和增殖。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。实验方法原理
应用黏粒载体构建基因组DNA文库
实验方法原理 在 λ 噬菌体中构建基因组 DNA 文库的步骤与在黏粒载体中的步骤基本一致。在这两种系统中，真核 DNA 在体外与载体 DNA 连接，形成能包装到 λ 噬菌体颗粒中的多联体。构建在 λ 噬菌体中的文库以具有感染性的重组噬菌体
噬神经元的腺病毒载体的构建
实验概要腺病毒载体，广泛用于外源基因转移到神经胶质细胞，具有细胞毒性。利用腺病毒载体转染神经细胞已经盛行，因为腺病毒载体除了感染细胞后有限的细胞毒性，还利于长期表达转基因。主要试剂人类胚胎肾（HEK）293T细胞腺病毒转移载体质粒腺病毒包装载体PLP1，pLP2（之前），PLP / VSVGDMEM
构建复制缺陷型疱疹单纯病毒载体实验（一）
作者已经有办法检测 HSV-IIE 基因功能并继而通过同源重组把外源基因引入 HSV-I 基因组。由于有些 HSV-IIE 基因—转染细胞蛋白 4(ICP4) 和 27(ICP27)—对所培养细胞的生长是很必要的，反向表达这些基因产物以补足细胞系对于分离和繁殖复制缺陷型病毒突变体是很有必要的。基本方
病毒包装技术——慢病毒载体构建及包装流程
一、实验流程（1和2为并列步骤）慢病毒过表达质粒载体的构建设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。
真核表达载体pcDNA3.1GFP的构建
【原理】引物中设计入限制酶位点：由于PCR引物的5'末端可以增加一些非互补碱基，因此可以在两引物的5'末端设计单限制酶或双限制酶切位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互补粘端的载体DNA重组。这种克隆方法效率较高，且当两引物中设计不同酶切位点时，可有效地定向克
Gateway克隆技术BP反应构建入门载体与LR反应构建表达载...
Gateway克隆技术-BP反应构建入门载体与LR反应构建表达载体的区别 提到克隆、重组载体，就想到5字金言：分、切、连、转、筛，“分”是指分离制备合格的待操作的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DN
中国农业大学最新报道可抑制口蹄疫病毒的转基因山羊
科学通报，中国科学C辑:生命科学，这两份期刊均是由中国科学院和国家自然科学基金委员会共同主办的，我国学术期刊中的知名品牌，被国内外各主要检索系统收录，如国内的《中国科学论文与引文数据库》(CSTPCD)、《中国科学引文数据库》(CSCD)等;美国的SCI、CA、EI，英国的SA，日本的《科技文献
miRNA、siRNA、dsRNA与shRNA－表示什么意思？
siRNA，shRNA，dsRNA，miRNA间的区别RNA干扰（RNAi），即用20多个核苷酸组成的短的双链RNA（siRNA）代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，已经迅速而广泛地应用到基因功能，基因表达调控机制研究等热门领域，并为基因治疗开辟了新的途径。近两年来，这方面的科学论文及报道爆炸性增长
The－TRC－shRNA设计方法与原则
OverviewWe design shRNA molecules with an algorithm. Our algorithm uses several criteria to rank potential 21mer targets within each human and mouse R
手把手教你设计shRNA
一、认识shRNA： 在研究基因功能中，RNAi由于可以特异性地使基因沉默或表达量降低而成为生物实验中的有力工具。其中，shRNA是可以克隆至表达载体并表达siRNA双链的DNA分子。今天给大家分享两种能快速设计shRNA的方法。 二、shRNA的设计: 1. Si
筛选构建于λ噬菌体载体的表达文库实验
在典型的免疫筛选实验中，λ噬菌体表达载体构建的文库应铺在不含异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG) 的大肠杆菌菌株的平板上。诱导物的缺少保证了噬菌斑顺利形成前不产生对宿主有毒性的融合蛋白，2~4 h 后，将平板从 42°C 移到 37°C 以稳定温度敏感型的所有融合蛋白。本实验来源于分子克隆实验指
筛选构建于λ噬菌体载体的表达文库实验
试剂、试剂盒 封闭缓冲液 氯仿 IPTG 抗原-抗体复合物检测试剂 SM TNT 缓冲液 洗涤缓冲液 放射
不得不看的载体构建的心得与体会
这两年在美帝净做克隆实验了，以前读PHD时候还觉得自己分子克隆挺牛X的，来这边之后做了各种各样的构建才知道以前是坐井观天，刚才粗粗统计了一下，在美帝一年零八个月，我构建的质粒的超过四百个，其中有很简单从PCR构建到拿WB结果的一共不到一周，也有巨难的花了四个月时间换了几次strategy才弄好激动得