cDNA文库组标准流程二:mRNA的分离
1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法 准备工作：1.将Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋转混匀，溶解Oligotex.,然后置于室温。2.将OBB Buffer置于37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。3.将OEB Buffer 置于70℃水浴中，待用。 试验步骤： 表3：加入试剂量据此表Total RNARNase-free Water to:Buffer OBB(ul)OligotexSuspension (ul)Prep size<=0.25mg250ul250ul15Mini0.25-0.5mg500ul500ul30Midi0.5-0.75mg500ul500ul45Midi0.75-1.00mg500ul500ul55Midi 1. &nbs......阅读全文
cDNA文库组标准流程二:mRNA的分离
1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法 准备工作：1.将Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋转混匀，溶解Oligotex.,然后置于室温。2.将OBB Buffer置于37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。3.将OEB Buffer 置于7
cDNA文库组标准流程6
2．pBlueScriptII的双酶切消化 1．以如下体系进行EcoRI酶切： pBSK(+) X µl（6µg） ddH2O 174-X µl 10×Buffer E 20 µl 混匀，加入限制性内切酶： EcoRI （10U/ µl） 6 µl 总体积为200 µl。 2．轻弹管壁或用枪头轻轻吹
cDNA文库组标准流程4
三．cDNA双链合成1.SupersciptII —RT合成第一链:1.在一RNase-free的0.2mlPCR管中,加入xul mRNA(大约500ng)1ul XhoIPrimer(1.4ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTT
cDNA文库组标准流程5
4EcoRIadaptor加接:1.往双链 cDNA沉淀中加入9ulEcoRI adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;2.溶解完成后,顺序加入下列试剂:1.2ul 10×Ligase Buffer1ul 10mMrATP1ul T4DNA Ligase(4U
cDNA文库组标准流程7
2．检测：（PCR方法）取适量PCR薄壁管，置于冰上，按以下体系依次加入：各试剂均加好后，离心机上甩一下，使之沉底，置于PCR仪上待 PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳，同时上1Kb DNA ladder半小时后照相，观察胶图：insert、vector
cDNA文库组标准流程1
一.Total RNA的提取 (一) 试剂配制 准备工作： 1.研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml /100ml容量瓶、药匙、 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。 2.50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料
cDNA文库组标准流程3
二.mRNA的分离 1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法 准备工作： 1.将Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋转混匀，溶解 Oligotex.,然后置于室温。 2.将OBB Buffer置于37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。 3.将
cDNA文库组标准流程2
(二)动物组织totalRNA的提取 1．根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中，冰浴5分钟。 2．将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆15-30秒/次，直到看不见组织和细胞碎片。 3．根据表1加入适量2M的乙酸钠（pH4.0）
cDNA文库组标准流程六:电转化流程
1．电转化感受态细胞的制备1. 用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照）2. 37℃，220rpm，培养14-16个小时。3. 第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中
cDNA文库组标准流程八:pBlueScript－cDNA库扩增
1．试剂及配方：2 x LB （1升）： 20g 氯化钠 20g 蛋白提取物 10g 酵母提取物 加入蒸馏水至1升，用NaOH调pH值至7.0，高压灭菌2 x LB－甘油（12.5%）（200ml）175ml 2 x LB液体2
cDNA文库组标准流程三:cDNA双链合成
1. Superscipt II—RT合成第一链:1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入 xul mRNA(大约500ng) 1ul Xho I Primer(1.4ug/ul) (5’ GAGAGAGAGAGAGAG
cDNA文库组标准流程四:载体制备
1．pBlueScriptII的提取1．取1ul商品的pBlueScriptII，转化入大肠杆菌宿主菌中，取5ul转化产物均匀涂布在含AMP的LB平板上，37℃培养过夜。2．第二天取一只无菌的50ml离心管，加入10ml AMP抗性的LB液体培养基，挑单克隆于离心管中，37℃，250rpm，培养过夜
cDNA文库组标准流程一:Total－RNA的提取
1.试剂配制准备工作：1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃ 20mins
cDNA文库组标准流程五:cDNA双链和载体的连接
1.连接：根据载体和cDNA的电泳定量结果，每个样品设置3个比例的连接，即：insert/vector=1/3 incert/vector=1/1 insert/vector=3/1按以下体系依次加入： ddH2O xulT4 ligase
cDNA文库组标准流程七:快速鉴定、菌落PCR
1．质粒快速鉴定 试剂：Protoplasting buffer:30mM Tris-HCl, pH8.0 0.33ml/1.0M 5mM EDTA 0.1ml/0.5M 50mM
cDNA－文库的构建（二）
7. 尽可能快地进行 cDNA 合成的下一步骤阶段 2:cDNA 第二链的合成材料缓冲液和溶液将贮存液稀释到合适浓度。氯仿EDTA(0.5mol/LpH8.0)乙醇MgCl2(1mol/L)(NH4)2SO4(1mol/L)将 1.3 g 固体硫酸铵溶解于终体积为 10 ml 的水中，溶液经滤膜过滤
cDNA文库分离基因的相关介绍
如果手中有足够量可产生抗体的来源于真核细胞的蛋白质，可以通过双抗体免疫法分离出此蛋白的基因。 基本原理： 核糖体沿mRNA进行多肽链合成时形成多聚核糖核蛋白体，而具有不同长度的新生肽链在核糖体上不断延伸。 将从细胞匀浆液中制备出的多聚核糖核蛋白体同特定抗体一起保温，形成多聚核糖体同抗体的复
基因组文库和cDNA文库的构建及筛选
刘芝华 中国医学科学院肿瘤研究所 分子肿瘤学国家重点实验室 概念： 基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体；cDNA文库是指含有所有重组cDNA的克隆群体。 基因组文库：来源于基因组DNA，反映基因组的全部信息，用于基因组物理图谱的构建，基因组序列分析，基因在染色体上
CDNA文库
CDNA文库（主要内容如下）· Construction of cDNA Library· Construction of Genome DNA Library· Library Screening OthersConstruction of cD
cDNA文库构建
实验方法原理 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。其基
cDNA文库构建
cDNA文库构建可以：（1）用于分离全长基因进而开展基因功能研究；（2）筛选目的基因并直接用于表达；（3）提供构建分子标记连锁图谱的所用探针。实验方法原理cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典 cDNA 文库构建
CDNA文库筛选
（一）λgt11 cDNA文库铺平板宿主细菌制备1．用一个E.coli宿主菌株单菌落分别接种2×5ml LB培养基（Y1088用于噬菌斑杂交，Y1090用于免疫筛选），于37℃振荡培养过夜。2．将过夜培养物以3000×g离心5min。3．分别用2ml λ-dil（10 mmol/L tris-Cl,
cDNA文库构建
cDNA文库[原理]：cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。CDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以第一条DNA链为模板复制
CDNA文库筛选
CDNA文库筛选（一）λgt11 cDNA文库铺平板宿主细菌制备1．用一个E.coli宿主菌株单菌落分别接种2×5ml LB培养基（Y1088用于噬菌斑杂交，Y1090用于免疫筛选），于37℃振荡培养过夜。2．将过夜培养物以3000×g离心5min。3．分别用2ml λ-dil（10 mmol/L
cDNA文库构建
cDNA文库构建 实验方法原理 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
cDNA－文库的构建
此经典方案建立在 Gubler-Hoffman 法（Gulber-Hoffman 1983) 之上，分为六个阶段。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）上册，作者：黄培堂。实验材料λ噬菌体臂大肠杆菌菌株用于λ噬菌体的包装抽提物试剂、试剂盒放线菌素 D二硫苏糖醇EDTATris-ClMgCl2反转录酶
cDNA－文库的构建
实验材料 λ噬菌体臂 大肠杆菌菌株 用于λ噬菌体的包装抽提物 试剂、试剂盒 放线菌素 D
cDNA－文库的构建2
阶段 3:cDNA 的甲基化材料缓冲液和溶液将贮存液稀释到合适浓度。氯仿10XEcoRⅠ 缓冲液1XEcoRⅠ 甲基化酶缓冲液（选用)如希望，可替代步骤 1 中的 Tris-HCl,NaCl 和 EDTA。EDTA(0.5mol/L,pH8.0)乙醇MgCl2(1mol/L)NaCl(5mol/L)
cDNA文库的构建1
分为六个阶段：阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链阶段2：cDNA第二链的合成阶段3：cDNA的甲基化阶段4：接头或衔接子的连接阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接 [阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链] 1.在置于冰上的无菌微
cDNA文库的物化方法
基因工程初始阶段所用的方法，已不用。利用核酸双螺旋之间存在着碱基G C，A T配对特性，分离目的基因。 例如：海胆rDNA分子内其G C含量可以达63%（其稳定性高，溶解温度高），通过热变性和S1酶解处理可得到提纯50倍的rDNA，最后经氯化铯平衡梯度离心，得到相对分子量为1.9X107Dal