cDNA文库组标准流程二:mRNA的分离
1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法 准备工作：1.将Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋转混匀，溶解Oligotex.,然后置于室温。2.将OBB Buffer置于37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。3.将OEB Buffer 置于70℃水浴中，待用。 试验步骤： 表3：加入试剂量据此表Total RNARNase-free Water to:Buffer OBB(ul)OligotexSuspension (ul)Prep size<=0.25mg250ul250ul15Mini0.25-0.5mg500ul500ul30Midi0.5-0.75mg500ul500ul45Midi0.75-1.00mg500ul500ul55Midi 1. &nbs......阅读全文
cDNA－文库的构建3
阶段 5:SepharseCL-4B 凝胶过滤法分离 cDNA材料缓冲液和溶液乙醇乙酸钠（3 ml/L,pH5.2)TE(pH7.6)含 0.1mol/LNaCl 的 TE(pH7.6)Tris-HCl(1mol/L,pH8.0)凝胶琼脂糖凝胶（1%)见步骤 8。核酸和寡核苷酸cDNA阶段 4 中步
cDNA－文库的构建2
阶段 3:cDNA 的甲基化材料缓冲液和溶液将贮存液稀释到合适浓度。氯仿10XEcoRⅠ 缓冲液1XEcoRⅠ 甲基化酶缓冲液（选用)如希望，可替代步骤 1 中的 Tris-HCl,NaCl 和 EDTA。EDTA(0.5mol/L,pH8.0)乙醇MgCl2(1mol/L)NaCl(5mol/L)
cDNA－文库的构建（三）
阶段 3:cDNA 的甲基化材料缓冲液和溶液将贮存液稀释到合适浓度。氯仿10XEcoRⅠ 缓冲液1XEcoRⅠ 甲基化酶缓冲液（选用)如希望，可替代步骤 1 中的 Tris-HCl,NaCl 和 EDTA。EDTA(0.5mol/L,pH8.0)乙醇MgCl2(1mol/L)NaCl(5mol/L)
cDNA－文库的构建（四）
方法cDNA 末端的削平1.cDNA样品（来自步骤 11)于 68°C 加热5 min。这一步骤是使cDNA分子的单链突出端可能形成的双链结构发生变性。2. 将cDNA溶液冷却至37°C并加入下列试剂：5xT4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液
cDNA－文库的构建（一）
实验材料 λ噬菌体臂大肠杆菌菌株用于λ噬菌体的包装抽提物试剂、试剂盒 放线菌素 D二硫苏糖醇EDTATris-ClMgCl2反转录酶RNase 抑制剂用于 cDNA 合成的寡核苷酸引物poly(A)+RNA[a-32P]dCTPEDTA乙醇(NH4)2SO4β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸T4
关于cDNA文库的简介
cDNA文库（cDNA library）：是指某生物某一发育时期所转录的mRNA全部经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA
cDNA文库的构建1
分为六个阶段：阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链阶段2：cDNA第二链的合成阶段3：cDNA的甲基化阶段4：接头或衔接子的连接阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接 [阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链] 1.在置于冰上的无菌微
消减－cDNA－或基因组－DNA－文库的制备实验
试剂、试剂盒 缓冲液、溶液和试剂酶和酶缓冲液核酸和寡核苷酸放射性化合物酚仪器、耗材 热循环仪水浴箱琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备实验步骤 第1阶段：RNA和DNA的分离一次双向消减，需要总量为2ug的基因组DNA或cDNA。大多数分离RNA和基因组DNA的方法都适用于本实验（Sambrooketal
消减－cDNA－或基因组－DNA－文库的制备实验
试剂、试剂盒 缓冲液、溶液和试剂 酶和酶缓冲液 核酸和寡核苷酸 放射性化合物 酚 仪器、耗材
消减－cDNA－或基因组－DNA－文库的制备实验
一次双向消减，需要总量为 2ug 的基因组 DNA 或 cDNA。大多数分离 RNA 和基因组DNA 的方法都适用于本实验（Sambrooketal.1989;ChomczynskiandSacchi1987;Farrell1993)。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。试
基因组DNA文库构建的基本流程
基因组 DNA文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为4大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。 一、分离基因组DN
构建cDNA文库的层析柱cDNA分级
这一步稍不注意会影响成功性或影响获得的cDNA的片段分布特点。这一步的操作要小心，尤其要在加入cDNA之前通过反复悬浮和试滴保证柱子能正常工作，cDNA的加入和收集要精力集中。获得的每一级的cDNA量很少，检测时带型很暗，所以要用新鲜做的透明薄胶检测，根据检测结果一定要舍弃太短的cDNA（一般4
cDNA文库构建技术cDNA链的反转合成
实验概要构建cDNA文库是一种获得目标基因并进一步进行基因重组，基因克隆的重要方法，而在该文库构建中有mRNA 逆转录出cDNA是一步极为关键的操作。mRNA的逆转录主要由MMLV、AMV两种逆转录酶催化合成cDNA，在这个逆转录过程中，模板mRAN及逆转录酶是两个最重要的影响因素。对于mR
cDNA文库构建技术cDNA链的反转合成
构建cDNA文库是一种获得目标基因并进一步进行基因重组,基因克隆的重要方法,而在该文库构建中有mRNA 逆转录出cDNA是一步极为关键的操作。mRNA的逆转录主要由MMLV、AMV两种逆转录酶催化合成cDNA，在这个逆转录过程中，模板mRAN及逆转录酶是两个最重要的影响因素。对于mRNA来讲，一
差减cDNA文库法
差减cDNA文库法[第一条链cDNA合成]1．合成第一条cDNA链时，所有试剂应按下列顺序依次加入：10×第一条链合成缓冲液 5.0μl10mM dNTP Mix(1.4μg/μl) 2.5μl(终浓度1.25mM)Linker prime
cDNA文库的构建和筛选
材料许多生物是疾病研究或探索使细胞和机体应对和存活于不同刺激下的分子适应机制的优良模型。 cDNA 文库的构建和随后目的基因的筛选可促使研究者发现在调节和响应某些外部特定环境压力中有重要作用，而在其他体系中可能不表达或者不存在的新基因。确定这些新基因的可读框，进一步分析其编码蛋白质的功能可以开创全新
关于cDNA文库的原理介绍
一、定义 （cDNA Library）某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，并将其引入到相应的宿主细胞中（一般为E.coli.）繁殖和扩增，理论上此群体就包含有该物种的全部mRNA信息，称该生物基因组的cDNA文库。 二、原理 经典cDNA文库构建的
mRNA的分离和纯化实验（二）
（三） mRNA的分离1、mRNA与Oligo(dT)-纤维素结合：用移液器重新悬浮oligo(dT)-纤维素，取适量的oligo(dT)-纤维素到RNA样品中，盖上盖子，颠倒数次将oligo(dT)-纤维素与RNA混匀。于37℃水浴保温并温和摇荡15min。oligo(dT)-纤维素与RNA所需量
关于cDNA文库的筛选鉴定的介绍
1．核酸杂交 是最常用，最可靠的方法之一，可大规模地分析文库的克隆子。 1．同源探针：至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列，常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆。 2．部分同源探针：探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同，常用于克隆家族基因。 3．总cDNA
目的基因的获取3
4、基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。 N：克隆数目 P：设定的概率值（如：0．99） x：插入片段平均大小（15～20kb） y：植物基因组大小（以kb计） 如果插入片段平均大小为 20 kb 某植物基因组大小为 4
差减cDNA文库法1
[第一条链cDNA合成] 1.合成第一条cDNA链时，所有试剂应按下列顺序依次加入： 10×第一条链合成缓冲液5.0μl 10mMdNTPMix(1.4μg/μl)2.5μl(终浓度1.25mM) Linkerprimer(1.4μl，终浓度100μg/μl) DEP
差减cDNA文库法3
[大量制备生产单链噬菌体DNA]1.新鲜过夜培养的宿主菌XLI-Blue，以1：20稀释在LB培养液中，在37℃培养扩增2小时。2.加1ml含单链cDNA的上清液。3.再于37℃继续培养2小时。4.然后将全部溶液转到500~1000mlLB中，生长5~6小时。5.9500rpm离心60分钟，除去细菌
差减cDNA文库法2
[cDNA末端磷酸化]1.70℃灭活反应后，稍微离心一下，置室温5分钟。2.在反应混合物（10μl）中加入：1μl10×连接缓冲液2μl10mMATP1μl（10μ）DNA激酶 [限制性内切酶消化]以得到粘性末端 1.限制性内切酶消化DNA和载体。 2.在37℃保温1~5小时，然后冷却到
cDNA文库构建的注意事项
构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。无论怎样，应当注意如下几个方面： 一、保证获得数量足够的高质量的起始RNA。构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RN
构建cDNA文库的注意事项
噬菌体文库或质粒文库均对载体与cDNA的连接效率要求很高，也对连接产物转染或转化大肠杆菌的效率要求很高。连接效率高低直接关系到文库构建是否成功，更要注意的是文库连接与一般的片段克隆的连接不一样。一般的片段克隆连接是固定长度的载体与固定长度的目的DNA连接，而文库连接是固定长度的载体与非固定长度的
差减－cDNA－文库的建立实验
基本方案 实验方法原理 实验材料 ［＋］ 和 ［-］cDNA 文库（ATCC 或 Stra
全长cDNA文库的构建—SMART技术
真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA的3'末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利
差减－cDNA－文库的建立实验
差减文库包含了存在于一种细胞或组织而不存在于另一种细胞或组织的 mRNA cDNA 克隆。这个 cDNA 文库被用来分离相应于一类 mRNA 的一组 cDNA 克隆，或用 于分离一个特定mRNA 的 cDNA 克隆。这中间筛选 cDNA 克隆的过程是很费劳力的。来源：《精编分子生物学实验指南（第五版
差减－cDNA－文库的建立实验
实验方法原理 实验材料 ［＋］ 和 ［-］cDNA 文库（ATCC 或 Stratagene）试剂、试剂盒 TE 缓冲液EcoRI EDTA蔗糖溶液琼脂糖凝胶TBE 缓冲液乙醇S1 核酸酶S1 核酸酶缓冲液苯酚 氯仿 异丙醇乙酸钠AluIRsaI去离子甲醜胺SDS酵母 tRNA氯仿 异丙醇磷
基因克隆技术1
一、目的基因的获得目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。目前用于获得目的基因的方法有几种，如限制性内切酶直接分离法、文库筛选法、体外扩增法和人工合成法等，其中限制性内切酶法直接分离目的基因和多聚酶链式反应（PCR）或逆转录-多聚酶链式