PCR产物定量实验
试剂、试剂盒 DNA 标准TEPCR 产物仪器、耗材 荧光计金属箔纸微量离心管实验步骤 方法 A: 荧光测定法荧光测定法可以在纳克级范围精确定量。荧光计和 DNA 定量试剂盒许多公司都有出售。确定荧光计是否安装了适合于特定染料的激发和发射的部件至关重要。该方法在设计上适用于配有带蓝色 LED 光源的滤光设备、微池附加器、试管（TurnerDesigns) 和 PicoGreen dsDNA Quantitation 试剂盒（Molecular Probes) 的微型焚光计。一、材料1. 缓冲液和溶液LambdaDNA 标准（100ug/ml)TE(10 mmol/LTris-HCl,lmmol/LEDTA,pH7.5)2. 核酸和寡核苷酸纯化的 PCR 产物3. 特殊设备荧光计、金属箔纸、微量离心管4. 其他PicoGreen dsDNA Quantitation 试剂盒 (MolecularProbes，P-758......阅读全文
PCR－产物定量实验
试剂、试剂盒 DNA 标准 TE PCR 产物 仪器、耗材 荧光计 金属箔纸
PCR－产物定量实验
测序之前对模板精确定量至关重要。根据 DNA 用量的多少，有几种不同的方法可供选择。下面介绍另外两种方法：荧光测定法和比较溴化物染色法。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。试剂、试剂盒DNA 标准TEPCR 产物仪器、耗材荧光计金属箔纸微量离心管实验步骤方法 A: 荧光测定
PCR－产物定量实验
试剂、试剂盒 DNA 标准TEPCR 产物仪器、耗材 荧光计金属箔纸微量离心管实验步骤 方法 A: 荧光测定法荧光测定法可以在纳克级范围精确定量。荧光计和 DNA 定量试剂盒许多公司都有出售。确定荧光计是否安装了适合于特定染料的激发和发射的部件至关重要。该方法在设计上适用于配有带蓝色 LED
PCR－产物纯化实验
介绍一个采用 AmiconMicrocon-PCR 滤件（Millipore) 的方法，有效地去除冗余dNTP 和引物的方法纯化 PCR 产物。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。试剂、试剂盒TE 或去离子水PCR 产物仪器、耗材离心机和转子PCR 滤 件微量离心管实验步骤
PCR－产物纯化实验
试剂、试剂盒 TE 或去离子水PCR 产物仪器、耗材 离心机和转子PCR 滤 件微量离心管实验步骤 一、材料1. 缓冲液和溶液TE(lOmmol/L Tris-HCl，lmmol/L EDTA，pH7.5) 或去离子水2. 核酸和寡核苷酸待测序的 PCR 产物3. 离心机和转子带有固定倾角转子的小型
PCR－产物纯化实验
试剂、试剂盒 TE 或去离子水 PCR 产物 仪器、耗材 离心机和转子 PCR 滤 件
定量PCR实验
实验材料 限制性内切核酸酶反转录酶热稳定 DNA 聚合酶dCTP靶核酸试剂、试剂盒 扩增缓冲液dNTP 贮存液胎盘 RNase 抑制剂仪器、耗材 琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶屏蔽型枪头离心管正向排液式移液器PCR 仪实验步骤 一、材料1. 缓冲液与溶液10X 扩增缓冲液4 种 dNTP 贮存液（20
PCR－产物电泳银染实验
实验方法原理 聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由丙烯酰胺单体和交联剂亚甲基双丙烯酰胺，在引发剂过硫酸胺（AP）提供自由基和催化剂四甲基乙二胺（TEMED）的作用下聚合而成。丙烯酰胺可由天然光线诱发聚合，所以其水溶液应贮藏在棕色瓶中，置低温 4℃ 更佳。由于其水溶液稳定性较差，通常 2 个月内用完为好。
PCR－产物电泳银染实验
常用的核酸电泳法有两种。①水平电泳：琼脂糖凝胶，紫外光下判断条带。此法经济省时，但分辨率较低。②垂直电泳：聚丙烯酰胺凝胶，可见光下判断条带。此法相对费力，但分辨率较高。分辨率高是聚丙烯酰胺电泳法被优先用于克隆性基因重排条带判断的关键。在聚丙烯酰胺凝胶上较宽弥散被判断为假阳性（阴性）的条带，在琼脂糖胶
PCR－产物电泳银染实验
实验方法原理聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由丙烯酰胺单体和交联剂亚甲基双丙烯酰胺，在引发剂过硫酸胺（AP）提供自由基和催化剂四甲基乙二胺（TEMED）的作用下聚合而成。丙烯酰胺可由天然光线诱发聚合，所以其水溶液应贮藏在棕色瓶中，置低温 4℃ 更佳。由于其水溶液稳定性
定量PCR技术基本原理和方法以及PCR产物的检测与定量3
1) 特异性捕获检测法（非探针杂交捕获）本法是非特异性检测PCR产物的一种方法，用生物素标记引物和地高辛标记duTP或用生物素和地高辛分别标记其引物。经PCR扩增后，PCR产物中同时掺入了生物素和地高辛。用生物素包被孔捕获PCR产物，用酶（AKP）标抗地高辛和产物反应，加底物显色进行定量，此法是非序
定量PCR技术基本原理和方法以及PCR产物的检测与定量2
1、非竞争内标定量PCR从细胞类标本中提取靶基因（核酸）时，同时会提取大量与靶基因无关的DNA或RNA；可以把这些靶基因无关DNA或 RNA作为内标与靶基因同步扩增，即在同样的反应条件下，在一个反应试管内同步扩增来自同一标本的一段靶基因序列和另一段无关的内标序列，不享受同一引物和引物结合位点，内
定量PCR技术基本原理和方法以及PCR产物的检测与定量1
聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是微量核酸扩增的有效工具，由于其灵敏、特异、快速等优点，在医学上已广泛应用与病毒、细菌病原体及遗传病、肿瘤的早期诊断。随着PCR技术的发展，特别是病毒或肿瘤的治疗监测、疾病的诊断、机体基因表达调控方面，不仅需要检测其存在
定量PCR实验技术－QPCR
Quantitative PCRJoseph SambrookPeter Maccallum Cancer Institute and The University of Melbourne, AustraliaDavid W. RussellUniversity of Texas Southwes
用－dUTP－净化－PCR－产物的实验
试剂、试剂盒 dNTP 溶液 MgCl2 溶液 PCR 缓冲液 引物 尿嘧啶-DNA-糖基酶 Taq DNA 聚合酶
用－dUTP－净化－PCR－产物的实验
在 PCR 扩增过程中将 dUTP 掺入复制子是最为有效和广泛使用的净化 PCR 产物的方法（Longoetal.1990;HartleyandRashtchian1995)。下面介紹这一方法的详细操作过程。本实验来源于PCR实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。试剂、试剂盒dNTP 溶液MgCl
用－dUTP－净化－PCR－产物的实验
试剂、试剂盒 dNTP 溶液 MgCl2 溶液PCR 缓冲液引物尿嘧啶-DNA-糖基酶 Taq DNA 聚合酶仪器、耗材 PCR 仪离心管实验步骤 一、材料1. 试剂（1）dNTP溶液（含有dATP、dCTP、dGTP和dUTP，每种浓度10 mmol/L)多数情况下，直接替换dUTP就可以
实验分析方法PCR扩增产物
孔板夹心杂交法： 该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特 异杂交使产物的间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素 等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一特异性较一次 杂交，漂洗后显色即可判断结果。该法需要两个杂交过程来检测 一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法
PCR实验技术指南之产物测序
1. DNA 直接测序：指直接分析不经分离的PCR 扩增产物，如果各个位点上碱基序列都是一致的，则所得信号是确定的，否则，在那些有相异碱基的位点出现模糊信号， 如果模板在多数情况下被正确扩增，则少数的突变将被掩盖，这是结果显示的是模板的序列.但是，当扩增的前几轮即出现错误扩增并被后续的循环积累，这时
定量PCR实验技术分享
1. 如果扩增曲线ct值比较靠后的话，32左右，一般有什么方法解决？ct值比较靠后，对实验有一定的影响，因为经过那么多次的循环，酶的活性有可能有所下降，这时候扩增效率会有所改变（而定量PCR的理论基础就是每次循环的扩增效率我们认为是确定的一个值）。因此最好能够把ct值往前移。解决办法可以将模板加以浓
定量PCR实验技术分享
1. 如果扩增曲线ct值比较靠后的话，32左右，一般有什么方法解决？ ct值比较靠后，对实验有一定的影响，因为经过那么多次的循环，酶的活性有可能有所下降，这时候扩增效率会有所改变（而定量PCR的理论基础就是每次循环的扩增效率我们认为是确定的一个值）。因此最好能够把ct值往前移。 解决办法可以将模
荧光定量PCR实验步骤
1、总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶） 1）取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。 2）取100mg组织，加入到匀浆器中。 3）充分研磨直至无可见组织块。 4）12000rpm离心10min取上清。 5）加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管
PCR产物克隆
克隆方法：1. 平端连接 通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条DNA链的3''末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3''突出一个碱基的DNA分子。这种DN
PCR产物克隆
克隆方法：1. 平端连接 通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条DNA链的3''''末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3'''&#
PCR产物克隆
PCR克隆主要有TA克隆法, 限制性酶切与连接法，杂交法和近期开发出来的特异性重组法等。但因为TA克隆法操作最简单，快速和高效的原因，成为Taq聚合酶PCR产物的最佳克隆方法。TA克隆法由Invitrogen发明，并拥有全球TA Cloning商标的ZL权。TA克隆方法（Original TA Cl
PCR扩增产物克隆的实验要点
引物设计主要是要注意以下几个事项： （1）发夹结构； （2）反向配对； （3）GC含量（40－60%）； （4）退火温度（45－65度）； （5）引物长度（18－27bp）； （6）3' 端最好是C、G（提高结合度）； （7）引物在序列中的错配位点。 大致就这几个方面，重要性
荧光定量PCR具体实验步骤
荧光定量PCR具体实验步骤，1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色
荧光定量PCR实验指南1
第一部分一、基本步骤：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反应体系的配制；5、反应条件的设定；6、反应体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备； 二、技术关键： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；
荧光定量PCR实验指南4
3.8 防止残余（Carry-over）污染PCR易受污染的影响，因为它是一种敏感的扩增技术。小量的外源DNA污染可以与目的模板一块被扩增。当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时，会发生共同来源的污染。这称之为残余污染。从其他样品中纯化的DNA或克隆的DNA也会是污染源（非残余污染）。可以在PCR过
定量PCR实验技术分享1
1. 如果扩增曲线ct值比较靠后的话，32左右，一般有什么方法解决没有 ct值比较靠后，对实验有一定的影响，因为经过那么多次的循环，酶的活性有可能有所下降，这时候扩增效率会有所改变（而定量PCR的理论基础就是每次循环的扩增效率我们认为是确定的一个值）。因此zui好能够把ct值往前移。 解决办法可以