Westernblot如何进行实验质控
WB实验总做不好，那么如何进行WB实验质控呢？ 做过WB实验的小伙伴都经历过成像时忐忑不安，出来结果时的彷徨无措，为什么条带没有出啦，为什么背景这么高，为什么受伤的总是我，看着旁边小伙伴漂亮的结果图，心生羡慕嫉妒，那么小编给大家整理总结了如何进行WB的质控和注意哪些检查点。 蛋白样品： 准备好裂解液后，使用BCA或Bradford等检测方法仔细测量蛋白浓度。进行上样时，确保加入等量的蛋白样品，以确保公平比较，从而最大限度地减少上样误差。不要使凝胶过载！如果您的表达目标非常低，可选择加样孔体积大的凝胶，这样可提高上样量。 阳性和阴性对照： 这些质控对于证明您的结果有效至关重要。阳性对照通常是裂解物或组织提取物，其具有过度表达的蛋白。当您的阳性对照未能发出信号时，您知道该方法可能存在问题。如果您正在使用重组蛋白，那么包含内源形式靶标的阳性对照也是一个好主意。这将有助于理清与一抗相关的任何特异性问题。......阅读全文
western－blot实验经验总结（一）
做了很久的WB（western blot），走了很多弯路，其实发现WB想要做好并不难，总结了WB实验中可能会遇到的问题，分析了可能的原因及对应的解决方案，希望能成为你实验成功的基石。 问题1：转膜不充分(1)膜没有完全均匀湿透使用100% methanol浸透膜。(2)靶蛋白分子量小于10 000选
western－blot原理
Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检
Western－Blot－Protocol
一、提取抗原蛋白将提取RNA途中留存的样品，加入150μl 100%酒精充分混匀，静置5min(RT), 2000×g , 4℃离心5min, 吸取上清至新管中, 加入750μl异丙醇, 混匀, 静置10min(RT), 12000×g, 4℃离心10min, 弃上清, 加入1ml 0.3mol/L
Western－Blot－(AP)
主要试剂1. Membrane Blocking buffer:5% Milk 0.05% of Tween 20 PBS2. antibody dilution buffer: PBS 0.05% of Tween20 1.0% Milk(or BSA) 3. washing buffer:
Western－Blot详解
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类
如何做出一手漂亮的Western－Blot实验结果？
蛋白质免疫印迹杂交实验（Western Blotting）是成熟 mRNA 翻译指导蛋白质合成量分析检测手段中最经典和最广泛为业界认可的一种,也是论文中最常见的数据呈现形式之一。虽然Western Blot实验原理比较简单，但是实验耗时长、步骤繁琐和实验结果重复性差，导致刚进实验室的小伙伴们
Western免疫印迹（Western－Blot）实验原理和主要试剂
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。实验原理与Southern或 Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电
如何在Western－Blot中选择一抗？
说到免疫印迹最重要的就是抗体的选择了。在免疫印迹中我们会用到一抗和二抗等抗体，本文着重给大家介绍一下一抗的选择。一抗就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。抗体因其种属来源不同可以分为多种类型，如鼠抗，兔抗，羊抗等等，那么在使用时我们应该怎么选择呢？检测任何一种目的蛋白都
western－blot中的一抗如何选择
一般选择的原则是去文献中找，看看别人做和你一样的目的蛋白的时候用的都是哪家得抗体，都有介绍的，看看图片效果怎么样。多找出一些文献，然后根据你掌握的信息选择一种最便宜，最高效，特异性最好的抗体。一般做科研的人都是这么选择抗体的，不能蒙着买，毕竟不便宜的。
如何用Western－blot法验证PCR结果？
往期我们已经为大家详细介绍了利用CRISPR/Cas9构建编辑小鼠和细胞系的全部过程，相信大家在了解从sgRNA设计、表达载体构建至显微注射、小鼠鉴定等一系列过程的同时，常会为这样的难题所困扰：历经3-6个月得到的基因敲除的小鼠/细胞，PCR鉴定的结果居然和WB蛋白结果不一致？竟开始怀疑自己这几个月
实验室Western－Blot荧光实验干货分享
听说隔壁实验室买了一台新成像，可以做Western Blot荧光扫描式Azure Sapphire成像，效果很好，操作也简单，小师妹一脸羡慕，问了句，我从来没做过荧光实验，现在期刊杂志要求也在升级，也建议使用荧光的方法，之前因为没有合适的仪器，所以不能尝试，现在可以准备我的实验了，那从化学到荧光
实验室Western－Blot荧光实验干货分享
听说隔壁实验室买了一台新成像，可以做Western Blot荧光扫描式Azure Sapphire成像，效果很好，操作也简单，小师妹一脸羡慕，问了句，我从来没做过荧光实验，现在期刊杂志要求也在升级，也建议使用荧光的方法，之前因为没有合适的仪器，所以不能尝试，现在可以准备我的实验了，那从化学到荧光
Western－Blot实验试剂的准备工作
1. 30%储备胶溶液： 丙烯酰胺（Acr） 29.0g 亚甲双丙烯酰胺（Bis） 1.0g 混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。2. 4×分离胶缓冲液（1mol/L Tris-HCl PH 8.8） Tris 18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调
Western－Blot实验相关试剂的配制（一）
30%(w/v)丙烯酰胺溶液 丙烯酰胺 29g甲叉双丙烯酰胺 1g加去离子水，定容至 100ml 调整溶液 pH 值不超过 7.0，置棕色瓶中贮存于室温或4℃。 10%SDS SDS 10g蒸馏水至
Western－Blot－实验试剂选购指南（二）
美国Pierce公司化 学 发 光 底 物 系 列4. Western Blotting检测试剂盒我们开发了此步免疫检测的完整的试剂盒,即HRP标记的二抗检测系统(含封闭液,洗液,底物,HRP/亲和素-二抗),您只需准备好一抗,并选择和一抗动物来源相应的试剂盒就可以.对于实验来说,采用完整的试剂盒可
Western－Blot实验相关试剂的配制（二）
100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）BSA 0.1g0.15 mol/L NaCl 1ml溶解后-20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，-20℃保存。
Western－blot实验步骤及注意事项
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适
电泳做Western－Blot实验的方法技巧
电泳做western blot的时候，大家往往会摸索一抗、二抗的浓度，封闭时间，曝光时间等等，而每次变换其中的一个条件就需要从新跑胶、转膜，甚至重新提蛋白，这样会浪费大量的时间。其实完全没有必要这样。一次转膜后，将PVDF膜晾干，裁减成小块，保存起来，用的时候取出一块，没有任何影响。这对于摸索条
Western－Blot－实验试剂选购指南（一）
(一)蛋白质电泳1.请参照常规电泳操作.2.分子量标准:可选择普通分子量标准或预染的分子量标准.在选择预染的分子量标准时,要注意其优点和缺点:优点: 在电泳过程中可监控蛋白质分离状态; 可指示转印中蛋白质的转印效率.缺点: 染料影响蛋白质移动速度;分子量测定略欠精确;影响蛋白质与膜的结合力. 购
使用激光光源进行NIR－western－blot检测的优势
Western blot方法是生物实验室常用的蛋白检测方法之一，自从1979提出至今已有数十年的历史。用于分析蛋白的表达情况。通过抗原抗体的特异性结合来检测靶标蛋白，常用的检测方法有化学发光法和荧光方法。荧光检测方法由于可以进行多重检测且信号稳定，越来越受到大家的青睐。二抗直接标记荧光基团，荧光
使用激光光源进行NIR－western－blot检测的优势
简介Western blot方法是生物实验室常用的蛋白检测方法之一，自从1979提出至今已有数十年的历史。用于分析蛋白的表达情况。通过抗原抗体的特异性结合来检测靶标蛋白，常用的检测方法有化学发光法和荧光方法。荧光检测方法由于可以进行多重检测且信号稳定，越来越受到大家的青睐。二抗直接标记荧光基团，
Western－Blot详解（三）
3.抗体 T.做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？ 解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。 U.同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的E
Western－Blot详解（八）
DDDD.显色目的条带又细又浅，靶蛋白是27KD的bcl-xl和67KD 的c-myc，应该是高表达。每个涌道上50-70μg蛋白，开始用半干转移，后来用湿转14v，16h，用PVDF膜转移。胶转移后染色检测，发现小分子量的基本转移走了，可是为什么条带老是不粗不浓呢?解答：可能跟你的一抗有关
Western－Blot详解－原理
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检
Western－Blot详解（四）
还有一种离子交换型膜是羧甲基（CM）修饰的纤维素膜，它可以结合蛋白和多肽分子，以及其他的一些带正电荷的样品，最适结合pH范围在4-7。结合的多肽分子可以从CM膜上洗脱下来，用于氨基酸系列分析或微测序。5.Marker的相关疑问MM.我用的是可视marker（BIO_RAD），但是电泳总跑不全8条带，
Western－Blot详解（六）
GGG.我想尽量提高转膜的效率（我的实验要求转到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些办法？解答：不管怎么转都会存在蛋白转移不完全（电压过小时间过短）或过度转移（电压过大时间过长）的问题，鱼（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建议把胶切成两半，比如以35KD为界，分别进
Western－Blot详解（一）
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学
Western－Blot操作步骤
背景： 蛋白质印迹的发明者是斯坦福大学George Stark。Neal Burnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中首次被称为Western Blot。最开始做印迹的是一个叫Southern的科学家，但印迹的对象是DNA链，他把这种技术称为Southe
Western－Blot详解（三）
3.抗体T.做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。U.同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的ELL+plus试剂盒显色。转膜过夜，
Western－Blot详解（五）
CCC.Western Stripping Buffer的配方解答：METHOD11、stripping buffer: 62.5mmol/l Tris PH6.7；100mmol/l beta-mercaptoethanol；2%SDS二次发光protocol:1.stripping buffer