重组酶聚合酶扩增叙述
重组酶聚合酶扩增（RPA），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物......阅读全文
关于基因扩增技术—聚合酶链反应的问题对策介绍
所有实验结果都有成功或失败，实验的失败可能是应该出结果而没有出，我们把它称作假阴性，不该出结果而出了结果我们把它称为假阳性。基因扩增技术—聚合酶链反应实验中最常见的问题就是假阴性和假阳性问题。 1、假阴性 出现假阴性结果最常见的原因是：Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制；引物设计不
基因扩增技术—聚合酶链反应的温度循环参数介绍
1、基因扩增技术—聚合酶链反应— 变性温度与时间 PCR反应中模板DNA的变性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR产物双链完全解开，才能有效的和引物结合。这种结合是PCR扩增的基础。变性温度越高，时间越长变性就越充分。但温度过高、时间过长又会影响Taq DNA聚合酶的活性，所以通常选用变性
酶促重组等温扩增（ERA）的原理和核心技术
酶促重组等温扩增技术(ERA技术)是一种等温核酸扩增技术,它是利用抗体制药领域先进的Molecular Design、Directed Evolution、Affinity Maturation 等技术手段,将来源于细菌,病毒和噬菌体的特定工具酶进行改造突变并筛选其功能,通过不同的核酸扩增反应体系进
关于基因扩增技术—聚合酶链反应的特异性介绍
首次报导的基因扩增技术—聚合酶链反应所用的DNA聚合酶是大肠杆菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90℃会变性失活，需每次PCR循环都要重新加入Klenow大片段，同时引物是在37℃延伸（聚合）易产生模板—引物之间的碱基错配、致特异性较差，1988年Saiki等从温
关于基因扩增技术—聚合酶链反应的操作程序介绍
过去标准的基因扩增技术—聚合酶链反应操作程序是将PCR必需反应成份分别加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。具体如下： （1）向一微量离心管中依次加入 DNA模板 102-105拷贝 引物 各1μmol/L dNTP 各200μmol/L 10×PCR缓冲液
关于基因扩增技术—聚合酶链反应的缓冲液介绍
基因扩增技术—聚合酶链反应反应的缓冲液的目的是给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8,20℃) Tris是一种双极性离子缓冲液，20℃时其pKa值为8.3，△pKa值为-0.021/℃。因此，20m
关于基因扩增技术—聚合酶链反应的凝胶电泳介绍
基因扩增技术—聚合酶链反应产物可通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，以前者最常用，通过电泳可以判断扩增产物的大小。在临床检测中，仅通过凝胶电泳判断扩增片段大小即可满足检测的需要。通常制胶方法为100mlTBE加1.5g琼脂糖在微波锅内溶解，稍冷后倒入电泳槽。 电泳后，用溴化乙淀染色20mi
关于基因扩增技术—聚合酶链反应的点杂交的介绍
当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适。这种方法的基本过程是，首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，再用放射性或非放射性标记物标记的探针杂交。点杂交还有助于检测突变DNA的突变类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。放射性同位素32P标记的寡核苷酸探针检测的敏感性、特异性和方法的可靠
分子实验方法8:聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆
第八章 聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆第一节 概 述 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Annea
激活的热稳定－DNA－聚合酶进行反转录和－DNA－扩增实验
试剂、试剂盒 RNA寡核苷酸引物 脱氧核苷三磷酸 RT RNA PCR 酶 AccuRT 缓冲液 UNG 琼脂糖 溴化乙锭
关于基因扩增技术—聚合酶链反应的微孔板夹心的介绍
基因扩增技术—聚合酶链反应是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异杂交使产物间接地固定于微孔板上。然后，再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域杂交，漂洗后显色即可判断结果，该法需要两个杂交过程来检测一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV
激活的热稳定－DNA－聚合酶进行反转录和－DNA－扩增实验
试剂、试剂盒 RNA寡核苷酸引物脱氧核苷三磷酸RT RNA PCR 酶AccuRT 缓冲液UNG琼脂糖溴化乙锭二甲基亚砜乙酸镁去除 RNA 酶的水SYBRGreen I Dye仪器、耗材 琼脂糖凝胶的电泳设备实验步骤 一、材料1. 缓冲液、溶液和试剂琼脂糖二甲基亚砜（见注释 1)(DMSO)溴化乙锭
关于基因扩增技术—聚合酶链反应的条件模板核酸的介绍
基因扩增技术—聚合酶链反应可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。不过RNA的扩增首先逆转录成cDNA后才能进行PCR循环。不同来源的核酸标本必须经处理后才能用于PCR的扩增，处理不当或处理过程中DNA掉失都会导致PCR扩增失败。采集标本方法不当，未能获得所要检测的靶DNA都会导致出现假阴
激活的热稳定－DNA－聚合酶进行反转录和－DNA－扩增实验
本实验介绍激活的热稳定 DNA 聚合酶进行反转录和 DNA 扩增。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。试剂、试剂盒RNA寡核苷酸引物脱氧核苷三磷酸RT RNA PCR 酶AccuRT 缓冲液UNG琼脂糖溴化乙锭二甲基亚砜乙酸镁去除 RNA 酶的水SYBRGreen I Dy
聚合酶的分类
可分为以下几个类群:(1)依赖DNA的DNA聚合酶；(2)依赖RNA的DNA聚合酶；(3)依赖DNA的RNA聚合酶；(4)依赖RNA的RNA聚合酶。前两者是DNA聚合酶，它使DNA复制链按模板顺序延长。如在原核生物中仅就大肠杆菌中已被发现的就有三种(分别简称为PolⅠ，PolⅡ和PolⅢ等)；D
聚合酶的分类
可分为以下几个类群:(1)依赖DNA的DNA聚合酶；(2)依赖RNA的DNA聚合酶；(3)依赖DNA的RNA聚合酶；(4)依赖RNA的RNA聚合酶。前两者是DNA聚合酶，它使DNA复制链按模板顺序延长。如在原核生物中仅就大肠杆菌中已被发现的就有三种(分别简称为PolⅠ，PolⅡ和PolⅢ等)；DNA
关于基因扩增技术—聚合酶链反应的影响条件Mg2+的介绍
Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性，这是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它还影响着引物的退火，模板与基因扩增技术—聚合酶链反应产物的解链温度，产物的特异性，引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，通常会导致非特异性扩增产物的累积。PCR混合物中的DNA模板，引物
可以DNA结合的酶聚合酶
聚合酶：聚合酶是从核苷三磷酸合成多核苷酸链的酶。它们通过向链上存在的先前核苷酸的3'-OH添加核苷酸起作用。因此，所有聚合酶都以5' - 3'方向起作用。DNA复制需要DNA依赖的DNA聚合酶，实现DNA序列的完美拷贝。有些DNA聚合酶具有校对功能，能够检测含氮碱基之间的错配
什么是重组酶？
中文名称重组酶英文名称recombinase定 义参与基因定位重组过程的酶。负责识别、切割特异的重组位点，并连接两个参与重组的分子。应用学科生物化学与分子生物学（一级学科），酶（二级学科）
RPA重组酶是什么？
2006 年，Piepenburg 等首次提出了重组酶聚合酶扩增反应(recombinase polymerase amplification,RPA)。它是由重组酶(T4 uvsX)、聚合酶(Bsu)和单链结合蛋白(gp32)以及两条特异性的上下游引物参与的等温扩增。 首先， T4 uvsX
聚合酶链[式]反应
中文名称聚合酶链[式]反应英文名称polymerase chain reaction;PCR定 义通过DNA互补双链解链、退火和聚合延伸的多次循环来扩增DNA特定序列的方法。应用学科细胞生物学（一级学科），细胞生物学技术（二级学科）
DNA聚合酶的特性
良好的热稳定性;70℃ 2h，残留90%活性;93℃ 2h，残留60%活性;94℃ 2h，残留40%活性。5'→3'聚合酶活性，对dATP有优先聚合活性;5'→3'外切酶活性;无3'→5'外切酶活性。
定量聚合酶链反应
中文名称定量聚合酶链反应英文名称quantitative PCR;qPCR定 义将某种已知含量的DNA模板作为内标准进行PCR反应，对待测模板进行定量分析的方法。更灵敏的定量PCR是采用实时PCR方法。应用学科细胞生物学（一级学科），细胞生物学技术（二级学科）
聚合酶的功能特性
聚合作用在引物RNA'-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐个将核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3'-OH与5
RNA聚合酶的类别
通常可根据生物的类别，将RNA聚合酶分为原核生物RNA聚合酶、真核生物RNA聚合酶。原核生物和真核生物的RNA聚合酶有共同特点，但在结构、组成和性质等方面又不尽相同。（1）原核生物RNA聚合酶 研究得最清楚的是大肠杆菌RNA聚合酶。该酶是由五种亚基组成的六聚体（α2ββ'ωσ）分子量约500
耐热DNA聚合酶简介
耐热DNA 聚合酶(Taq DNA 聚合酶)：1969年人们从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离出一种嗜热的水生真菌Thermusaquaticus,能在70~ 75C生长,从该菌分离纯化得到一种耐热的、依赖DNA 的DNA 聚合酶,简称Taq DNA 聚合酶。 耐热DNA聚合酶是一种可抗高温
DNA聚合酶的功能
1）通过核苷酸聚合反应，使DNA链沿5’→3’方向延长（DNA聚合酶活性）[1] 2）催化由3’端水解DNA链（3’→ 5’核酸外切酶活性，用于切除错配的碱基）[1] 3）催化由5’端水解DNA链（5’→ 3’核酸外切酶活性，用于切除引物）[1] 4）催化由3’端使DNA链发生焦磷酸解
DNA聚合酶的特性
DNA聚合酶有多种，E.coli就有三种。通常DNA聚合酶具有以下共同特点： ①需要DNA模板，因此这类酶又称为依赖DNA的DNA聚合酶；②需要RNA或DNA作为引物(primer)，即DNA聚合酶不能从头催化； ③催化dNTP加到引物的3'-OH末端，其速率为1000nt/min，因而DN
聚合酶的分类介绍
可分为以下几个类群:(1)依赖DNA的DNA聚合酶；(2)依赖RNA的DNA聚合酶；(3)依赖DNA的RNA聚合酶；(4)依赖RNA的RNA聚合酶。前两者是DNA聚合酶，它使DNA复制链按模板顺序延长。如在原核生物中仅就大肠杆菌中已被发现的就有三种(分别简称为PolⅠ，PolⅡ和PolⅢ等)；D
DNA聚合酶的应用
E.coli的DNA pol Ⅰ涉及DNA损伤修复，在半保留复制中起辅助的作用。DNA polⅡ在修复损伤中也具有重要的作用。DNA polⅢ是一种多亚基的蛋白质，在DNA新链的从头合成中起复制酶的作用。复制的忠实性问题会影响到翻译的精确性，这种忠实性主要依赖于碱基的特异性配对。据估计每个碱基对将有