WesternBlot的过程与优化，着重于化学发光检测（三）
四、化学发光信号4.1 信号捕捉虽然化学发光蛋白质印迹法十分常用，但是对于难于捕获的信号的捕捉却很棘手。蛋白质印迹法要用到一系列需要技巧的技术，因此许多因素都会导致无法捕捉到信号。由于变量较多 (表 33. 2)，问题印迹的问题诊断和排除就如同大海捞针一样困难。传统的方案在检测某一个蛋白质时通常都是无效的。例如 ， 一 抗可能无法识别变性状态下的固定化抗原。尽管在非变性环境下蛋白质可保持天然状态，但这却使得目标蛋白质分子质量的确定更具挑战。此外，超大型或疏水蛋白质通常会阻碍有效的膜转移。另外，小型蛋白质 (小于等于 10 kDa) 会从膜孔中穿出，无法与膜结合。因此, 为确保能够用于检测靶物质，Towbin 的原始方案一再被修改。这些修改包括使用不同的试剂进行间接检测或 4标记的一抗进行直接检测。有时可以完全跳过转移这一步骤，在凝胶内完成检测（Desaiet al.,2001)。体 持 续 时 间 取 决......阅读全文
Western Blot的过程与优化，着重于化学发光检测（三）
四、化学发光信号4.1 信号捕捉虽然化学发光蛋白质印迹法十分常用，但是对于难于捕获的信号的捕捉却很棘手。蛋白质印迹法要用到一系列需要技巧的技术，因此许多因素都会导致无法捕捉到信号。由于变量较多 (表 33. 2)，问题印迹的问题诊断和排除就如同大海捞针一样困难。传统的方案在检测某一个蛋白质时通常
Western Blot的过程与优化，着重于化学发光检测
实验步骤一、蛋白质印迹法蛋白质印迹 (Western Blotting) 法是在混合的复合物中鉴定和定量特定蛋白质的一种有效且常用的方法 (Towbin et al. ,1979)。这一技术对固定在硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯 (PVDP) 膜上的蛋白质样本进行非直接的检测。在常规的蛋白质印迹中，蛋白
Western Blot的过程与优化，着重于化学发光检测
实验步骤 一、蛋白质印迹法 蛋白质印迹 (Western Blotting) 法是在混合的复合物中鉴定和定量特定蛋白质的一种有效且常用的方法 (Towbin et al. ,1979)。这一技术对固定在硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯
Western Blot的过程与优化，着重于化学发光检测3
六、使用化学发光底物的印迹法和操作规程的优化6.1 使 用 化 学 发 光 底 物 的 蛋 白 质 印 迹 法(1) 凝胶电泳分离蛋白质样品。(2) 制备转移缓冲液。采 用 4 〇 0 m L 超 纯 水 制 备 Tris— 甘氨酸转移缓冲液，再加人IOOmL 甲醇。 4°C 下 使 用 和 保 存
Western Blot的过程与优化，着重于化学发光检测（五）
5.7.1 分析方法间 的 底 物 孵 育 会 延 长 信 号 持 续 时 间 。使 用 W e s t P i c o 或 W e s t D u r a 底 物 能 检 测 到 低 至10 n g 的 蛋 白 质 , 甚 至 在 完 成 蛋 白 质 印 迹 的 64 h 后 依 然 可
Western Blot的过程与优化，着重于化学发光检测2
四、化学发光信号4.1 信号捕捉虽然化学发光蛋白质印迹法十分常用，但是对于难于捕获的信号的捕捉却很棘手。蛋白质印迹法要用到一系列需要技巧的技术，因此许多因素都会导致无法捕捉到信号。由于变量较多 (表 33. 2)，问题印迹的问题诊断和排除就如同大海捞针一样困难。传统的方案在检测某一个蛋白质时通常都是
Western Blot的过程与优化，着重于化学发光检测（四）
五、常见问题及其原因5.1 没 有 信 号初 次 曝 光 时 未 捕 获 到 化 学 发 光 信 号 , 表 明 该 蛋 白 质 印 迹 系 统 需 要 优 化 。通 常 , 信 号 缺失 由 系 统 中 酶 量 (即 HRP) 过 多 造 成 。当 信 号 不 能 被 检 测 到 时 ，采
Western Blot的过程与优化，着重于化学发光检测（一）
一、蛋白质印迹法蛋白质印迹 (Western Blotting) 法是在混合的复合物中鉴定和定量特定蛋白质的一种有效且常用的方法 (Towbin et al. ,1979)。这一技术对固定在硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯 (PVDP) 膜上的蛋白质样本进行非直接的检测。在常规的蛋白质印迹中，
Western Blot的过程与优化，着重于化学发光检测（二）
2.3 半定量蛋白质印迹法通 常 认 为 蛋 白 质 印 迹 法 是 定 性 的 ，但 当 加 入 特 定 对 照 时 ，它 也 可 成 为 一 种 定 量 方 法 。当 E L I S A 无 法 用 于 某 种 样 本 ，或 是 当 生 物 样 本 中 的 某 种 组 分 会 干 扰 E
Western Blot，如何成功优化？
Western Blot 现在仍然是检测和分离蛋白最常用的一种实验方法，但是要想得到较好的结果并不容易，只有找到合适的实验条件并进行优化，才能以更少的时间得到更多的结果，达到事半功倍的效果！下面是 R&D Systems 品牌为您推荐的免疫印迹优化步骤和实验涉及参考数据：一抗浓度对实验结果的