定点诱变实验
实验材料 DNA试剂、试剂盒 TE寡核苷酸引物质粒dNTPDNA聚合酶氯仿石蜡油无水乙醇仪器、耗材 离心管热循环仪离心机实验步骤 1. 利用突变区两侧的限制性内切酶位点将待诱变的DNA片段亚克隆进高拷贝数的载体中。 2. 用小量制备的质粒提取模板DNA，用TE缓冲液重悬100 ng DNA至终浓为1 ng/μl。 3. 合成寡核苷酸引物，以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯化，重悬于500 μl TE缓冲液中，在A260吸光度，调整浓度至500 ng/μl。 4. 往两个500 μl 量离心管加入下列试剂，其中一管加寡核苷酸1，另一管加寡核苷酸2：10 μl 10×扩增反应缓冲液10 μl 2 mmol/l 4种dNTP1 μl 寡核苷酸1或21 μl 适当的M13侧翼序列引物，正向或反向加水至99.5 μl......阅读全文
定点诱变实验
实验材料 DNA试剂、试剂盒 TE寡核苷酸引物质粒dNTPDNA聚合酶氯仿石蜡油无水乙醇仪器、耗材 离心管热循环仪离心机实验步骤 1. 利用突变区两侧的限制性内切酶位点将待诱变的DNA片段亚克隆进高拷贝数的载体中。 2. 用小量制备的质粒提取模板DNA，用TE缓冲液重悬100 ng DNA至终浓
定点诱变实验
基本方案 利用PCR引物点突变 实验材料 DNA 试剂、试剂盒
定点诱变(DpnI法)
1、引物设计：每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45bp,设计的突变位点需位于引物中部。2、反应：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ;循环次数少，一般为12个循环。反应体系：10x pyrobest Buffer 5 uldN
定点诱变(DpnI法)
1、引物设计：每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45bp,设计的突变位点需位于引物中部。2、反应：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ;循环次数少，一般为12个循环。反应体系：10x pyrobest Buffer 5 uldNTP Mixture(10mM) 1ul模板DN
定点诱变实验——基本方案
定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。实验材料DNA试剂、试剂盒TE寡核
关于基因定点诱变的概述
对于任何一种遗传学研究，尤其是有关基因的结构与功能的分析，突变都是最基本的手段。经典的方法是，应用能够修饰DNA分子的化学诱变剂或物理诱变剂处理生物体。此类诱变方法虽然已得到了广泛的应用，获得了大量的突变体，但亦存在着诸多的不便之处。 第一、经受诱变剂处理的生物体，它的任何基因都有可能发生突变
寡核苷酸定点诱变的概念
中文名称寡核苷酸定点诱变英文名称oligonucleotidedirected mutagenesis定 义人工获得特定核酸定点突变的一种方案。将需要改变的核苷酸置于一段合成的寡核苷酸中部，在单链噬菌体(如M13)模板上用克列诺酶合成有指定变化的负链，再通过噬菌体复制得到含突变的双链。应用学科生物
定点诱变实验——利用PCR引物点突变
实验材料DNA试剂、试剂盒DNA聚合酶klenow限制性内切酶仪器、耗材水浴锅离心机培养箱实验步骤1. 制备模板（见基本方案，步骤1和2） 2. 合成和纯化寡核苷酸引物并对5‘端磷酸化。 3. 扩增模板DNA（基本方案，步骤4和5），在最后一次延伸结束后，加5 U 的klenow酶，30℃保温
定点诱变与盒式诱变的比较介绍
构建一个位点导向的文库涉及使用含有一个或多个简并密码子的合成DNA片段替代一个基因片段。这可以通过双链盒式诱变或单链寡核苷酸定向诱变来实现。我们相对倾向于寡核苷酸定向诱变，因为不同于盒式诱变，它不需要在目的区域附近有独特的限制性酶切位点，并且构建一个文库只需要一个寡核苷酸片段。因此，这个方法相当
分子遗传学词汇寡核苷酸定点诱变
中文名称：寡核苷酸定点诱变英文名称：oligonucleotide-directed mutagenesis定 义：用人工合成的寡核苷酸在特定位点导致突变。应用学科：遗传学（一级学科），分子遗传学（二级学科）
寡聚核苷酸定点诱变技术的基本原理
寡聚核苷酸定点诱变技术是由加拿大的生物化学家M.史密斯（1932）发明的。其基本原理如下：应用寡聚核苷酸进行DNA的定点诱变时，首先要把含有待突变的DNA片段克隆到MI3噬菌体载体中，MI3噬菌体的正链可以感染具有纤毛的细菌，并在细菌体内进行复制后，以出芽的形式形成新的带有正链DNA的噬菌体。而存留
利用大引物－PCR－在同一试管中进行高效快速定点诱变实验
试剂、试剂盒 扩增缓冲液含有四种 dNTP 的混合溶液热稳定 DNA 聚合酶琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶正向和反向内引物诱变引物模板 DNA仪器、耗材 带屏障装置的自动移液器用吸头微型离心机用离心管可调式移液器实验步骤 材料缓冲液和溶液贮存液，缓冲液和试剂的成分请参阅附录 1。将贮存液稀释到合适的浓度
利用大引物－PCR－在同一试管中进行高效快速定点诱变实验
大引物方法最初是由 KAMMANN 等人（1989）建立的，现在的方法是经过许多研究人员包括 Sarkat 和 Sommer (1990,1992), Giebel 和 Spritz(1990)，Landt 等（1990),Marini 等（1993), Picard 等（1994),Ling 和
利用大引物－PCR－在同一试管中进行高效快速定点诱变实验
试剂、试剂盒 扩增缓冲液 含有四种 dNTP 的混合溶液 热稳定 DNA 聚合酶 琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶 正向和反向内引物 诱变引物
盒式诱变的简介
盒式诱变(cassette mutagenesis)是一种定点诱变技术，其方法是利用一段人工合成的具有突变序列的双链寡核苷酸片段，取代野生型基因中相应序列。这种诱变的双链寡核苷酸片段是由两条人工合成的寡核苷酸链组成的，当它们退火时，会按照设计要求产生出克隆需要的粘性末端。这些合成的寡核苷酸片段就
用放射性标记的寡核苷酸杂交筛选定点诱变重组克隆实验
实验方法原理 试剂、试剂盒 甲酸铵寡核苷酸杂交溶液寡核苷酸预杂交液TE噬菌体T4多核苷酸激酶限制性内切核酸酶琼脂糖凝胶诱变寡核苷酸[γ-32P]ATP2XYT 顶层琼脂和 2xYT 琼脂平皿 仪器、耗材 钝端镊子皮下注射用针头（18 号）和印度墨水孵箱硝酸纤维素膜或尼龙膜真空烤箱68°C 水
用放射性标记的寡核苷酸杂交筛选定点诱变重组克隆实验
实验方法原理 试剂、试剂盒 甲酸铵 寡核苷酸杂交溶液 寡核苷酸预杂交液 TE 噬菌体T4多核
用放射性标记的寡核苷酸杂交筛选定点诱变重组克隆实验
本方案主要描述了筛选噬菌体 M13 重组克隆，而一种选择方案是筛选含噬菌粒的细菌克隆。最后也介绍了用 PCR 检测突变体的方法。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。实验方法原理试剂、试剂盒甲酸铵寡核苷酸杂交溶液寡核苷酸预杂交液TE噬菌体T4多核
关于寡核苷酸引物诱变的介绍
寡核苷酸引物诱变是由加拿大生物化学家Michael Smith发明的一种基因定点诱变方法。其基本原理是：合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，其中含有需要改变的碱基，使其与带有目的基因的单链DNA配对，合成的引物除短的错配区外，与目的基因完全互补，然后用DNA聚合酶延伸引物，完成单链DNA的复制。
什么是蛋白质设计？
蛋白质设计是新蛋白质分子的合理设计，旨在设计新的活性，行为或目的，并增进对蛋白质功能的基本了解。可以从头开始设计蛋白质（从头设计），也可以通过对已知蛋白质结构及其序列进行计算得出的变体进行设计（称为蛋白质重新设计）。合理的蛋白质设计方法可以预测蛋白质序列，并将其折叠成特定的结构。然后可以通过诸如肽合
蛋白质工程提高稳定性的作用介绍
提高蛋白质的稳定性包括以下几个方面： （1）延长酶的半寿期； （2）提高酶的热稳定性； （3）延长药用蛋白的保存期； （4）抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。 葡萄糖异构酶（GI）在工业上应用广泛，为提高其热稳定性，朱国萍等人在确定第138位甘氨酸(Gly138)为目标氨基酸后，用
简述细菌性溶血素的结特征
pLY是所有肺炎球菌临床分离株所表达的一种53kDa蛋白，是革兰阳性菌的具同源结构和抗原的溶细胞素族中的一员。对克隆的PLY定点诱变确定了有关细胞毒性的关键区。邻近羧基端的11个氨基酸序列是细胞毒性所必需的，这个序列在所有巯基激活毒素中均高度保守，并含有单个半胱氨酸。而其他区域则涉及膜胆固醇结合
何为PCR,说明其原理及其应用
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术.PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加
关于盒式诱变法的基本信息介绍
基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区域性的突变。常用的方法如盒式突变法，又称片段取代法。这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段(这种合成的片段被称为盒)，来置换或取代目标基因中的相应序列。这种用于突变的盒可以是任意
蛋白质工程：跨学科研究揭神奇面纱
在基因工程基础上发展起来的蛋白质工程，被称为“第二代基因工程”。在亚太地区蛋白质学会主席、北京大学跨院系蛋白质科学中心主任昌增益教授看来，蛋白质工程不仅蕴涵着人类攻克癌症等生命难题的重大契机，其在产业化上的巨大发展空间也是不言而喻的。 近年来，蛋白质工程研究和应用已遍及医疗、工业、农
生物物理所在金属蛋白理性设计研究方面获得进展
11月29日，中科院生物物理所王江云研究组以Probing the Function of the Tyr-Cys Crosslink in Metalloenzymes through the Genetic Incorporation of 3-Methylthiotyros
结核杆菌研究新进展：乙酰化修饰图谱公布
近日，发表于杂志Int J Biochem Cell Biol.上的一篇文章中，来自西南大学和杭州景杰生物科技有限公司的研究者公布了结核分歧杆菌的乙酰化修饰谱图。近年来科学家都非常有兴趣致力于病原微生物的蛋白质翻译后修饰研究，本文中作者首次全面鉴定了结核分歧杆菌的乙酰化修饰。这也是继公布首张结合
概述细菌性溶血素的毒力功能
PLY在侵袭性肺炎球菌感染的早期发病机理中具有增强肺炎球菌毒力的多种功能。PLY是最重要的成孔毒素，能破坏构成呼吸道机械屏障的上皮组织。PLY能损害近端下呼吸道的纤毛清除机理，并促进肺炎球菌对破坏的支气管上皮细胞间隙的粘附，从而促进增殖的细菌进入下呼吸道。 PLY还能损害下呼吸道中的肺泡-毛细
离心机在血型选取上的应用
输血时如血型不合会造成患者出现输血的不良反应，因此使用相符的血型是输血安全的前提保证。而作为人类的重要遗传标志-血型，在近年科学的发展下，人们逐步探索分析，已发现300余种现人类红细胞血型抗原。当今，世界多国正努力建立稀有血型细胞血库，当中对所发现的稀有血型，如Rh、MNSs、P、Kell、Kidd
成对免疫球蛋白样受体唾液酸识别机制研究获进展
成对免疫球蛋白样受体α和β（paired immunoglobulin-like type 2 receptor α/β, PILRα/PILRβ）是参与先天免疫调控的重要表面分子，在不同的物种中高度保守。两种分子均在胞外“暴露”相似的单个免疫球蛋白样结构域以结合相应的配体；但结合配体后，却利用