利用大引物PCR在同一试管中进行高效快速定点诱变实验
试剂、试剂盒 扩增缓冲液含有四种 dNTP 的混合溶液热稳定 DNA 聚合酶琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶正向和反向内引物诱变引物模板 DNA仪器、耗材 带屏障装置的自动移液器用吸头微型离心机用离心管可调式移液器实验步骤 材料缓冲液和溶液贮存液，缓冲液和试剂的成分请参阅附录 1。将贮存液稀释到合适的浓度。10x 扩增缓冲液含有四种 dNTP 的混合溶液，每一种 dNTF 的浓度为 2.5 mmol/L酶和缓冲液热稳定 DNA 聚合酶 [Hot-Tub DNA 聚合酶（Amersham) 或同类产品]大多数 DNA 聚合酶保存在含 50% 甘油的贮存液中。这种溶液非常粘稠，很难准确取量。最简单的方法是在微型离心机上将含酶的离心管在 4°C 以最大转速离心 10s, 然后用一个可调式移液器取出所需数量的酶。用一个带屏障装置的自动移液器装配 PCR 反应成分。凝胶1% 的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶（含 0.5ug/ml 溴化乙锭）......阅读全文
定点诱变实验
实验材料 DNA试剂、试剂盒 TE寡核苷酸引物质粒dNTPDNA聚合酶氯仿石蜡油无水乙醇仪器、耗材 离心管热循环仪离心机实验步骤 1. 利用突变区两侧的限制性内切酶位点将待诱变的DNA片段亚克隆进高拷贝数的载体中。 2. 用小量制备的质粒提取模板DNA，用TE缓冲液重悬100 ng DNA至终浓
定点诱变实验
基本方案 利用PCR引物点突变 实验材料 DNA 试剂、试剂盒
定点诱变实验——基本方案
定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。实验材料DNA试剂、试剂盒TE寡核
定点诱变实验——利用PCR引物点突变
实验材料DNA试剂、试剂盒DNA聚合酶klenow限制性内切酶仪器、耗材水浴锅离心机培养箱实验步骤1. 制备模板（见基本方案，步骤1和2） 2. 合成和纯化寡核苷酸引物并对5‘端磷酸化。 3. 扩增模板DNA（基本方案，步骤4和5），在最后一次延伸结束后，加5 U 的klenow酶，30℃保温
定点诱变(DpnI法)
1、引物设计：每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45bp,设计的突变位点需位于引物中部。2、反应：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ;循环次数少，一般为12个循环。反应体系：10x pyrobest Buffer 5 uldNTP Mixture(10mM) 1ul模板DN
定点诱变(DpnI法)
1、引物设计：每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45bp,设计的突变位点需位于引物中部。2、反应：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ;循环次数少，一般为12个循环。反应体系：10x pyrobest Buffer 5 uldN
关于基因定点诱变的概述
对于任何一种遗传学研究，尤其是有关基因的结构与功能的分析，突变都是最基本的手段。经典的方法是，应用能够修饰DNA分子的化学诱变剂或物理诱变剂处理生物体。此类诱变方法虽然已得到了广泛的应用，获得了大量的突变体，但亦存在着诸多的不便之处。 第一、经受诱变剂处理的生物体，它的任何基因都有可能发生突变
寡核苷酸定点诱变的概念
中文名称寡核苷酸定点诱变英文名称oligonucleotidedirected mutagenesis定 义人工获得特定核酸定点突变的一种方案。将需要改变的核苷酸置于一段合成的寡核苷酸中部，在单链噬菌体(如M13)模板上用克列诺酶合成有指定变化的负链，再通过噬菌体复制得到含突变的双链。应用学科生物
利用大引物－PCR－在同一试管中进行高效快速定点诱变实验
大引物方法最初是由 KAMMANN 等人（1989）建立的，现在的方法是经过许多研究人员包括 Sarkat 和 Sommer (1990,1992), Giebel 和 Spritz(1990)，Landt 等（1990),Marini 等（1993), Picard 等（1994),Ling 和
利用大引物－PCR－在同一试管中进行高效快速定点诱变实验
试剂、试剂盒 扩增缓冲液 含有四种 dNTP 的混合溶液 热稳定 DNA 聚合酶 琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶 正向和反向内引物 诱变引物
利用大引物－PCR－在同一试管中进行高效快速定点诱变实验
试剂、试剂盒 扩增缓冲液含有四种 dNTP 的混合溶液热稳定 DNA 聚合酶琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶正向和反向内引物诱变引物模板 DNA仪器、耗材 带屏障装置的自动移液器用吸头微型离心机用离心管可调式移液器实验步骤 材料缓冲液和溶液贮存液，缓冲液和试剂的成分请参阅附录 1。将贮存液稀释到合适的浓度
定点诱变与盒式诱变的比较介绍
构建一个位点导向的文库涉及使用含有一个或多个简并密码子的合成DNA片段替代一个基因片段。这可以通过双链盒式诱变或单链寡核苷酸定向诱变来实现。我们相对倾向于寡核苷酸定向诱变，因为不同于盒式诱变，它不需要在目的区域附近有独特的限制性酶切位点，并且构建一个文库只需要一个寡核苷酸片段。因此，这个方法相当
分子遗传学词汇寡核苷酸定点诱变
中文名称：寡核苷酸定点诱变英文名称：oligonucleotide-directed mutagenesis定 义：用人工合成的寡核苷酸在特定位点导致突变。应用学科：遗传学（一级学科），分子遗传学（二级学科）
关于寡聚核苷酸的定点诱变技术介绍
是由加拿大的生物化学家M·史密斯（Michael Smith，1932—）发明的。其基本原理如下： 应用寡聚核苷酸进行DNA的定点诱变时，首先要把含有待突变的DNA片断段克隆到MI3噬菌体载体中，MI3噬菌体的正链可以感染具有纤毛的细菌，并在细菌体内进行复制后，以出芽的形式形成新的带有正链DN
用放射性标记的寡核苷酸杂交筛选定点诱变重组克隆实验
实验方法原理 试剂、试剂盒 甲酸铵 寡核苷酸杂交溶液 寡核苷酸预杂交液 TE 噬菌体T4多核
用放射性标记的寡核苷酸杂交筛选定点诱变重组克隆实验
实验方法原理 试剂、试剂盒 甲酸铵寡核苷酸杂交溶液寡核苷酸预杂交液TE噬菌体T4多核苷酸激酶限制性内切核酸酶琼脂糖凝胶诱变寡核苷酸[γ-32P]ATP2XYT 顶层琼脂和 2xYT 琼脂平皿仪器、耗材 钝端镊子皮下注射用针头（18 号）和印度墨水孵箱硝酸纤维素膜或尼龙膜真空烤箱68°C 水浴What
用放射性标记的寡核苷酸杂交筛选定点诱变重组克隆实验
本方案主要描述了筛选噬菌体 M13 重组克隆，而一种选择方案是筛选含噬菌粒的细菌克隆。最后也介绍了用 PCR 检测突变体的方法。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。实验方法原理试剂、试剂盒甲酸铵寡核苷酸杂交溶液寡核苷酸预杂交液TE噬菌体T4多核
寡聚核苷酸定点诱变技术的基本原理
寡聚核苷酸定点诱变技术是由加拿大的生物化学家M.史密斯（1932）发明的。其基本原理如下：应用寡聚核苷酸进行DNA的定点诱变时，首先要把含有待突变的DNA片段克隆到MI3噬菌体载体中，MI3噬菌体的正链可以感染具有纤毛的细菌，并在细菌体内进行复制后，以出芽的形式形成新的带有正链DNA的噬菌体。而存留
盒式诱变的简介
盒式诱变(cassette mutagenesis)是一种定点诱变技术，其方法是利用一段人工合成的具有突变序列的双链寡核苷酸片段，取代野生型基因中相应序列。这种诱变的双链寡核苷酸片段是由两条人工合成的寡核苷酸链组成的，当它们退火时，会按照设计要求产生出克隆需要的粘性末端。这些合成的寡核苷酸片段就
什么是蛋白质设计？
蛋白质设计是新蛋白质分子的合理设计，旨在设计新的活性，行为或目的，并增进对蛋白质功能的基本了解。可以从头开始设计蛋白质（从头设计），也可以通过对已知蛋白质结构及其序列进行计算得出的变体进行设计（称为蛋白质重新设计）。合理的蛋白质设计方法可以预测蛋白质序列，并将其折叠成特定的结构。然后可以通过诸如肽合
关于寡核苷酸引物诱变的介绍
寡核苷酸引物诱变是由加拿大生物化学家Michael Smith发明的一种基因定点诱变方法。其基本原理是：合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，其中含有需要改变的碱基，使其与带有目的基因的单链DNA配对，合成的引物除短的错配区外，与目的基因完全互补，然后用DNA聚合酶延伸引物，完成单链DNA的复制。
简述细菌性溶血素的结特征
pLY是所有肺炎球菌临床分离株所表达的一种53kDa蛋白，是革兰阳性菌的具同源结构和抗原的溶细胞素族中的一员。对克隆的PLY定点诱变确定了有关细胞毒性的关键区。邻近羧基端的11个氨基酸序列是细胞毒性所必需的，这个序列在所有巯基激活毒素中均高度保守，并含有单个半胱氨酸。而其他区域则涉及膜胆固醇结合
蛋白质工程提高稳定性的作用介绍
提高蛋白质的稳定性包括以下几个方面： （1）延长酶的半寿期； （2）提高酶的热稳定性； （3）延长药用蛋白的保存期； （4）抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。 葡萄糖异构酶（GI）在工业上应用广泛，为提高其热稳定性，朱国萍等人在确定第138位甘氨酸(Gly138)为目标氨基酸后，用
何为PCR,说明其原理及其应用
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术.PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加
实验动物实验标本的采集实验
(1) 大鼠、小鼠的采血方法：①剪尾采血：适用于少量采血，如制作血涂片、白细胞计数等。动物麻醉后，将尾尖剪去约 5 mm, 待血液流出采集。也可用刀割破尾动脉或尾静脉，让血液自行流出。小鼠可每次采血约 0. 1 ml, 大鼠约 0.4 ml。②眼眶后静脉丛采血：一手拇指及食指抓住鼠两耳之
实验室实验器材使用实验
1、了解化学试剂的等级和保管原则2、掌握玻璃器械的规范使用3、明确各玻璃器械的功用试剂、试剂盒纯水仪器、耗材量筒容量瓶吸管移液管吸球天平温度什移液瓶实验步骤一、实验材料：不同等级的化学试剂 量材 量筒 容量瓶 吸管（移液管 无分度两标线管 有分度吸管 微量吸管）吸球二、实验步骤：1. 根据试剂瓶上的
实验室实验器材使用实验
试剂、试剂盒 纯水仪器、耗材 量筒 容量瓶 吸管移液管 吸球天平温度什 移液瓶实验步骤 一、实验材料：不同等级的化学试剂 量材 量筒 容量瓶 吸管（移液管 无分度两标线管 有分度吸管 微量吸管）吸球二、实验步骤：1. 根据试剂瓶上的标志说明该试剂的等级及保管方法2，玻璃量器的使用：按照玻璃量器上的标
实验动物实验标本的采集实验——实验动物脑脊液采集
实验材料实验动物试剂、试剂盒消毒液仪器、耗材注射器实验步骤(1) 狗、兔脑脊液的采集：通常采取脊髓穿刺法，穿刺部位在两髂连线中点稍下方第七腰椎间隙。动物麻醉后侧卧位固定，头尾部尽量弯向腰部，去被毛。消毒后一手固定穿刺部位的皮肤，腰穿针垂直刺入，当有落空感及动物的后肢跳动时，针已达椎管内，抽去针芯，即
实验动物实验标本的采集实验——实验动物尿液采集
实验材料实验动物试剂、试剂盒水仪器、耗材收集器实验步骤尿液的采集 常用的采集方法较多，一般在实验前需给动物灌服一定量的水。(1) 代谢笼法：此法较常用，适用于大、小鼠。将动物放在特制的笼内。一般需收集 5 小时以上的尿液，最后取平均值。(2) 导尿法：常用于雄性兔、狗。动物轻度麻醉后，固定于手术台上
实验动物实验标本的采集实验——实验动物腹水的采集
实验材料实验动物试剂、试剂盒消毒液仪器、耗材注射器实验步骤抽取大鼠、小鼠的腹水时，抓取固定动物，使动物腹部朝上，消毒皮肤，针头在腹股沟和腹中线之间刺人腹腔，腹压高时腹水自然流出，腹水少时可用注射器抽取。