定点诱变(DpnI法)
1、引物设计：每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45bp,设计的突变位点需位于引物中部。2、反应：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ;循环次数少，一般为12个循环。反应体系：10x pyrobest Buffer 5 uldNTP Mixture(10mM) 1ul模板DNA(5~50ng) 1ulprimer 1 (125ng) 1ulprimer 2 (125ng) 1ulpyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5U/ul) 0.25ul加无菌蒸馏水至 50ul 3、产物沉淀纯化：加1/10 体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上（或-20゜C冰箱）5min,离心弃上清，70~75%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中。（此步可省略，直接用 DpnI酶切） 4、DpnI酶切：Buffer 2ul BSA（100╳） 0.2ul DNA x ul Dp......阅读全文
定点诱变(DpnI法)
1、引物设计：每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45bp,设计的突变位点需位于引物中部。2、反应：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ;循环次数少，一般为12个循环。反应体系：10x pyrobest Buffer 5 uldN
定点诱变(DpnI法)
1、引物设计：每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45bp,设计的突变位点需位于引物中部。2、反应：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ;循环次数少，一般为12个循环。反应体系：10x pyrobest Buffer 5 uldNTP Mixture(10mM) 1ul模板DN
定点诱变实验
基本方案 利用PCR引物点突变 实验材料 DNA 试剂、试剂盒
定点诱变实验
实验材料 DNA试剂、试剂盒 TE寡核苷酸引物质粒dNTPDNA聚合酶氯仿石蜡油无水乙醇仪器、耗材 离心管热循环仪离心机实验步骤 1. 利用突变区两侧的限制性内切酶位点将待诱变的DNA片段亚克隆进高拷贝数的载体中。 2. 用小量制备的质粒提取模板DNA，用TE缓冲液重悬100 ng DNA至终浓
定点诱变实验——基本方案
定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。实验材料DNA试剂、试剂盒TE寡核
关于基因定点诱变的概述
对于任何一种遗传学研究，尤其是有关基因的结构与功能的分析，突变都是最基本的手段。经典的方法是，应用能够修饰DNA分子的化学诱变剂或物理诱变剂处理生物体。此类诱变方法虽然已得到了广泛的应用，获得了大量的突变体，但亦存在着诸多的不便之处。 第一、经受诱变剂处理的生物体，它的任何基因都有可能发生突变
寡核苷酸定点诱变的概念
中文名称寡核苷酸定点诱变英文名称oligonucleotidedirected mutagenesis定 义人工获得特定核酸定点突变的一种方案。将需要改变的核苷酸置于一段合成的寡核苷酸中部，在单链噬菌体(如M13)模板上用克列诺酶合成有指定变化的负链，再通过噬菌体复制得到含突变的双链。应用学科生物
定点诱变实验——利用PCR引物点突变
实验材料DNA试剂、试剂盒DNA聚合酶klenow限制性内切酶仪器、耗材水浴锅离心机培养箱实验步骤1. 制备模板（见基本方案，步骤1和2） 2. 合成和纯化寡核苷酸引物并对5‘端磷酸化。 3. 扩增模板DNA（基本方案，步骤4和5），在最后一次延伸结束后，加5 U 的klenow酶，30℃保温
定点诱变与盒式诱变的比较介绍
构建一个位点导向的文库涉及使用含有一个或多个简并密码子的合成DNA片段替代一个基因片段。这可以通过双链盒式诱变或单链寡核苷酸定向诱变来实现。我们相对倾向于寡核苷酸定向诱变，因为不同于盒式诱变，它不需要在目的区域附近有独特的限制性酶切位点，并且构建一个文库只需要一个寡核苷酸片段。因此，这个方法相当
分子遗传学词汇寡核苷酸定点诱变
中文名称：寡核苷酸定点诱变英文名称：oligonucleotide-directed mutagenesis定 义：用人工合成的寡核苷酸在特定位点导致突变。应用学科：遗传学（一级学科），分子遗传学（二级学科）
关于寡聚核苷酸的定点诱变技术介绍
是由加拿大的生物化学家M·史密斯（Michael Smith，1932—）发明的。其基本原理如下： 应用寡聚核苷酸进行DNA的定点诱变时，首先要把含有待突变的DNA片断段克隆到MI3噬菌体载体中，MI3噬菌体的正链可以感染具有纤毛的细菌，并在细菌体内进行复制后，以出芽的形式形成新的带有正链DN
寡聚核苷酸定点诱变技术的基本原理
寡聚核苷酸定点诱变技术是由加拿大的生物化学家M.史密斯（1932）发明的。其基本原理如下：应用寡聚核苷酸进行DNA的定点诱变时，首先要把含有待突变的DNA片段克隆到MI3噬菌体载体中，MI3噬菌体的正链可以感染具有纤毛的细菌，并在细菌体内进行复制后，以出芽的形式形成新的带有正链DNA的噬菌体。而存留
DNA定点突变实验
实验方法原理 定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。单点突变的原理是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提得到质粒。设计一对包含突变位点的
关于定点突变的单点突变的介绍
对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。准备突变的质粒必须是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。设计一对包含突变位
利用大引物－PCR－在同一试管中进行高效快速定点诱变实验
大引物方法最初是由 KAMMANN 等人（1989）建立的，现在的方法是经过许多研究人员包括 Sarkat 和 Sommer (1990,1992), Giebel 和 Spritz(1990)，Landt 等（1990),Marini 等（1993), Picard 等（1994),Ling 和
利用大引物－PCR－在同一试管中进行高效快速定点诱变实验
试剂、试剂盒 扩增缓冲液 含有四种 dNTP 的混合溶液 热稳定 DNA 聚合酶 琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶 正向和反向内引物 诱变引物
利用大引物－PCR－在同一试管中进行高效快速定点诱变实验
试剂、试剂盒 扩增缓冲液含有四种 dNTP 的混合溶液热稳定 DNA 聚合酶琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶正向和反向内引物诱变引物模板 DNA仪器、耗材 带屏障装置的自动移液器用吸头微型离心机用离心管可调式移液器实验步骤 材料缓冲液和溶液贮存液，缓冲液和试剂的成分请参阅附录 1。将贮存液稀释到合适的浓度
DNA定点突变实验
DNA定点突变可用于：（1）研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性；（2）改造启动子或者DNA作用元件；（3）提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。实验方法原理定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以
DNA定点突变实验
DNA定点突变实验 实验方法原理 定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方
Sitedirected－Mutagenesis－using－PCR
Site-directed Mutagenesis using PCRMichael P. Weiner, Tim Gackstetter, Gina L. Costa, John C. Bauer, and Keith A. KretzFrom: Molecular Biology: Curren
基因定点突变step－by－step
本文先讲最简单的一个点的定点突变技术，其它较长片段的突变，删除，插入技术以后会慢慢奉上： 在做实验之前，我们首先要搞清楚实验的目的和实验的原理。 实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做： 第一 我们吊出来的基因有点突变
基因定点突变step－by－step
本贴先讲最简单的一个点的定点突变技术，其它较长片段的突变，删除，插入技术以后会慢慢奉上：在做实验之前，我们首先要搞清楚实验的目的和实验的原理。实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：第一：我们吊出来的基因有点突变，相信
基因定点突变step－by－step
本贴先讲最简单的一个点的定点突变技术，其它较长片段的突变，删除，插入技术以后会慢慢奉上：在做实验之前，我们首先要搞清楚实验的目的和实验的原理。实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：第一：我们吊出来的基因有点突变，相信
蛋白质工程提高稳定性的作用介绍
提高蛋白质的稳定性包括以下几个方面： （1）延长酶的半寿期； （2）提高酶的热稳定性； （3）延长药用蛋白的保存期； （4）抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。 葡萄糖异构酶（GI）在工业上应用广泛，为提高其热稳定性，朱国萍等人在确定第138位甘氨酸(Gly138)为目标氨基酸后，用
用放射性标记的寡核苷酸杂交筛选定点诱变重组克隆实验
实验方法原理 试剂、试剂盒 甲酸铵 寡核苷酸杂交溶液 寡核苷酸预杂交液 TE 噬菌体T4多核
用放射性标记的寡核苷酸杂交筛选定点诱变重组克隆实验
本方案主要描述了筛选噬菌体 M13 重组克隆，而一种选择方案是筛选含噬菌粒的细菌克隆。最后也介绍了用 PCR 检测突变体的方法。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。实验方法原理试剂、试剂盒甲酸铵寡核苷酸杂交溶液寡核苷酸预杂交液TE噬菌体T4多核
用放射性标记的寡核苷酸杂交筛选定点诱变重组克隆实验
实验方法原理 试剂、试剂盒 甲酸铵寡核苷酸杂交溶液寡核苷酸预杂交液TE噬菌体T4多核苷酸激酶限制性内切核酸酶琼脂糖凝胶诱变寡核苷酸[γ-32P]ATP2XYT 顶层琼脂和 2xYT 琼脂平皿仪器、耗材 钝端镊子皮下注射用针头（18 号）和印度墨水孵箱硝酸纤维素膜或尼龙膜真空烤箱68°C 水浴What
盒式诱变的简介
盒式诱变(cassette mutagenesis)是一种定点诱变技术，其方法是利用一段人工合成的具有突变序列的双链寡核苷酸片段，取代野生型基因中相应序列。这种诱变的双链寡核苷酸片段是由两条人工合成的寡核苷酸链组成的，当它们退火时，会按照设计要求产生出克隆需要的粘性末端。这些合成的寡核苷酸片段就
定点突变技术：从单点突变到多点突变
体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组 研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究
定点突变技术――从单点突变到多点突变
体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组 研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我