自杀性质粒载体的构建
自杀性质粒载体完全可以自己构建，只要保证两点：１，自杀性质粒载体不能在你的宿主菌里进行复制，也就是说载体上不能有能在宿主菌中复制的复制子；２，要由筛选标记． 自杀性质粒载体不能在你的宿主菌里进行复制，否则会导致细菌染色体突变株的构建失败。但是在构建时，要注意以下方面：1。在制备质粒载体和DNA插入片断时：2ug 5kb大小的线状DNA大约含有1.4poml/L5'末端磷酸。5‘突出端脱磷需要CIP0.01u/pmolDNA末端，平端或凹陷脱磷需CIP0.5u/pmolDNA末端。2。连接质粒载体和DNA插入片断时：（1）初次实验的可以建立几种不同的连接体系，比如插入片段与载体分子数比率可以为3：1，1：1，或1：3。（2）可以尝试三种温度和时间的连接如4度，过夜；15度，4－6小时；25度，1小时。3。细菌转化和筛选时：（1）如果是感受态细胞，－80度储存的在5－6周后,转化率低。可用一已知标准闭环质粒鉴定感受......阅读全文
自杀性质粒载体的构建
自杀性质粒载体完全可以自己构建，只要保证两点：１，自杀性质粒载体不能在你的宿主菌里进行复制，也就是说载体上不能有能在宿主菌中复制的复制子；２，要由筛选标记． 自杀性质粒载体不能在你的宿主菌里进行复制，否则会导致细菌染色体突变株的构建失败。但是在构建时，要注意以下方面：1。在制备质粒载体和DNA插入片
质粒克隆载体的设计和构建的原则
①选择合适的出发质粒出发质粒也叫亲本质粒，它应含有质粒克隆载体必备的元件，如复制起始位点、选择标记基因、克隆位点、启动子和终止子等。②正确获得构建质粒克隆载体的元件一般采用限制性核酸内切酶切割出质粒DNA分子，获得含有某种元件的DNA片段，还可以采用PCR技术从靶DNA中扩增出含某种元件的特异性DN
筛选质粒载体构建表达文库实验
试剂、试剂盒 封闭缓冲液氯仿裂解缓冲液检测抗原-抗体复合物所用试剂SMTNT 缓冲液洗涤缓冲液 125I 标记的蛋白质 A 或 125I 标记的免疫球蛋白放射性碘化第二抗体第一抗体LB 或 SOB 琼脂平板仪器、耗材 空气培养箱平头镊子 装有防水黑墨水（印度墨水）并带有 18 号针头的注射器硝酸纤维
筛选质粒载体构建表达文库实验
试剂、试剂盒 封闭缓冲液 氯仿 裂解缓冲液 检测抗原-抗体复合物所用试剂 SM TNT 缓冲液 洗涤缓冲液
筛选质粒载体构建表达文库实验
检测结合抗体的方法有以下 3 种：放射化学筛选，生色反应筛选及化学发光反应筛选。3 种方法的优缺点在本章导言中有所论述。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。试剂、试剂盒封闭缓冲液氯仿裂解缓冲液检测抗原-抗体复合物所用试剂SMTNT 缓冲液洗涤缓
质粒克隆载体的设计和构建过程遵循的原则
①选择合适的出发质粒 出发质粒也叫亲本质粒,它应含有质粒克隆载体必备的元件,如复制起始位点、选择标记基因、克隆位点、启动子和终止子等。 ②正确获得构建质粒克隆载体的元件 一般采用限制性核酸内切酶切割出质粒DNA分子,获得含有某种元件的DNA片段,还可以采用PCR技术从靶DNA中扩增出含某种
通过自杀质粒同源重组构建细菌突变株
自杀性质粒载体：一般用于基因突变。将突变的目的基因克隆到自杀性质粒载体上，通过接合等使其进入宿主，由于在宿主菌中不存在复制基因启始所需的复制蛋白（如Pi蛋白等），其无法复制，在外界选择性压力的作用下,自杀性质粒载体所携带的突变基因就与宿主染色体上的野生型发生基因发生二次同源重组，产生了带有突变的突变
质粒载体的载体大小的介绍
大的质粒（大于15kb）不会很好转化而且DNA产量通常很低。在设计实验时要考虑到加入插入片段的最终载体大小，尽量用更小的载体。 兼容性 当多于一个质粒载体必须同时存在于同一个细菌细胞中，这两个质粒的复制子必须是兼容的。当他们不能稳定地共存时，则认为这两个质粒是不兼容的。 选择/检测插入片段
质粒与载体
一、质粒绝大多数的生物都是以DNA 的形式来储藏其遗传信息。遗传物质要能生生不息地传给后代的首要条件就是它至少要具有一个复制原(ori, origin of replication，或译为复制起点)，使整个基因体得以复制。含有复制原的遗传物质称为replicon，我们姑且把它译为为复制体吧！原核性复
质粒载体的分类
按复制形式分为严紧型和松弛型复制。根据质粒DNA复制与宿主之间的关系或在宿主细胞的拷贝数的多少，可以将质粒分为两种不同的复制类型：严紧型和松弛型。严紧型质粒复制受宿主染色体DNA复制的严格控制，拷贝数较小一般只有1~3个拷贝。疏松型质粒的复制宿主的控制比较松，在宿主中的拷贝数比较多，一般有10~20
重组质粒的构建
[实验原理]外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA
简述慢病毒载体的载体质粒
载体质粒上HIV-1的顺式序列通常包括两端的LTR、剪切位点及包装信号Ψ等。此外，研究表明，gag基因5′端的序列可提高载体RNA的包装效率；Rev蛋白需要与Rev反应元件(RRE)相作用，将未剪切的载体转录产物从细胞核转运到胞浆。因此，Naldini等在载体上保留了gag基因5′端350bp的
质粒载体的改造意义
⑴去掉不必要的DNA区段。⑵减少限制酶的识别位点，一种酶只保留一个。（单一的限制性酶切位点）。⑶加入易于捡出的选择性标记基因。⑷对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便 转移。⑸改造或增加基因表达的调控序列。
酵母质粒载体的特点
酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体(shuttlevector)。在基因工程中，应用上述病毒表达载体在哺乳动物细胞中进行中、小规模的表达是十分实际的。还要有对组织培养技术十分熟悉的前提。但病毒载体的运用仍然存在技术较难、耗时间和不经济的问题
关于质粒载体的简介
质粒是小型环状DNA分子,大小为1～200kb(1kb=1000碱基对)。质粒不同于病毒,是裸露的DNA分子,没有外壳蛋白,在基因组中,也没有溶菌酶基因。质粒在宿主细胞内才能完成自身复制,同时将编码的一些非染色体控制的遗传性状进行表达,赋予宿主细胞一些额外的特性,包括抗性特性、代谢特性等,其中对
酵母质粒载体的特点
酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以在酵母系统中复制与扩增,故此类载体又称为穿梭载体(shuttlevector)。 在基因工程中,应用上述病毒表达载体在哺乳动物细胞中进行中、小规模的表达是十分实际的。还要有对组织培养技术十分熟悉的前提。但病毒载体的运用仍然存在技术较难、耗时间和不经
pUC质粒载体结构
（1）来自于pBR322的Ori（2）氨苄青霉素的抗性基因(ampr)。 但核苷酸序列发生了变化（3） LacZ′基因编码β—半乳糖酶的α—肽链即氨基末端。（4）MCS区段是一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的。
什么是质粒载体？
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的质粒。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。
质粒载体是什么？
质粒载体是基因工程重要的载体之一。它是以质粒 DNA 分子为基础构建而成，主要用 于原核生物和植物的基因转移以及建立基因组文库和cDNA 文库。现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工改造，从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同类型的质粒载体。近年来
siRNA表达载体的构建
实验方法原理 多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U
siRNA表达载体的构建
实验方法原理 多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol
植物表达载体的构建
实验概要本实验介绍了一种构建植物表达载体的方法。实验步骤1. 植物正义表达载体的构建 1) 用SmaI和SacI双酶切pTriplEx2-GhMT3a和植物表达载体pBI121： 2) 进行琼脂糖凝胶电泳，回收GhMT3a片段和pBI121载体； 3) 连接：连接体系为：混匀后4-
siRNA表达载体的构建
siRNA表达载体构建可应用于：（1）作为后基因组时代基因功能分析的有力工具；（2）基因组学、细胞信号传导通路分析；（3）药物靶点筛选、疾病治疗。实验方法原理多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RN
RNAi表达载体构建
近年来的研究表明，一些短片断的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型， 称为RNA干扰（RNA interference，RNAi）。siRNA（small interfering RNAs）就是这种短片断双链RNA分子，能够
RNAi表达载体构建
近年来的研究表明,一些短片断的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型, 称为RNA干扰（RNA interference,RNAi）.siRNA（small interfering RNAs）就是这种短片断双链RNA分子,能够
shRNA干扰载体构建
产品技术背景pRI系列载体是基于III类RNA聚合酶启动子：人类H1启动子的专用于哺乳动物细胞RNA干扰的载体。H1启动子在哺乳动物细胞内合成类似siRNA分子的小分子RNA。由于H1启动子有精确的转录起始位点和终止信号，H1启动子转录产物精确生成人工设计的shRNA，shRNA经过RISC剪切后形
shRNA干扰载体构建
产品技术背景pRI系列载体是基于III类RNA聚合酶启动子：人类H1启动子的专用于哺乳动物细胞RNA干扰的载体。H1启动子在哺乳动物细胞内合成类似siRNA分子的小分子RNA。由于H1启动子有精确的转录起始位点和终止信号，H1启动子转录产物精确生成人工设计的shRNA，shRNA经过RISC剪切后形
常用的质粒载体有哪些
载体种类：质粒、噬菌体、腺病毒载体、逆转录病毒载体质粒特点：存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。具有自我复制功能。带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。经改造后具有多克隆位点。举例：pMD-18T质粒、pUCl9质粒、pBR322质粒等
柯斯质粒载体的特性
1、具有l噬菌体的特性 柯斯质粒连接上适宜长度的外源DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的DNA也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。2、具有质粒载体的特性 能象质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆
柯斯质粒载体的特点
柯斯质粒是一类人工构建的含有lDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid是cos site carrying plasmid的缩写。柯斯质粒的大小为4-6kb，由3部分组成：A.多克隆位点区B. 含有cos位点的lDNA区C. 复制起始位点和抗性标记区