PCR技术（十六）：PCR产物测序
PCR技术代替了为测序而反复进行的分子克隆和模板制备步骤。PCR技术与自动测 序技术相结合后，它将成为一种最快、最有效的测定核苷权序列的方法。本章主要综 述各种测模板的制备以及如何完成PCR产物的直接测序。与传统的将PCR片段克隆入质 粒或病毒基因组相比，直接序列分析有两个主要的优点:1)由于它是一个不依赖于生 物体(如细菌、病毒等)的体外系统，因而它更容易标准化(即例于自化2);对于每个待 测样品，只需测定一个单链序列，因而它也就更快和更准确。相比之下，间接测序为 了区别在PCR反应过程中由DNA聚合酶引入的随机错朽核苷酸所引起的原始基因组序列 中的突变，以及由体外重组而产生的人工扩增产物，如产生镶嵌等位基因(混合克隆) 等，每个样品不得不测定几个PCR产物克隆的序列。 不需借助在细菌中克隆就可直接获得清蜥和准确的序列结果，其难易程度取决 于:1)只扩增靶序列的PCR引物的扩增能力(通常称为PCR特异性);2用以获笪测序模板......阅读全文
PCR技术（十六）：PCR产物测序
PCR技术代替了为测序而反复进行的分子克隆和模板制备步骤。PCR技术与自动测 序技术相结合后，它将成为一种最快、最有效的测定核苷权序列的方法。本章主要综 述各种测模板的制备以及如何完成PCR产物的直接测序。与传统的将PCR片段克隆入质 粒或病毒基因组相比，直接序列分析有两个主要的优点:1)由于它是一
PCR产物测序结果分析
pcr产物测序的最大风险是有在凝胶上看起来的一个条带，实际上有多个分子。也就是说长度相似的分子有可能在电泳的时候只有一条带。如果只是进行pcr产物回收，没有进行凝胶分离的过程的话，东西可能更多了。问题就在于，如果出现双峰或者多峰，这个样品就白送了，什么也结果也没有。特别你现在用的还是简并引物，本身目
DNA测序电泳前测序PCR产物的处理
1. 加入12 μl的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。 2. 将溶液转移至盖体分离的0.2 ml PCR管中，稍离心。 3. 在PCR仪上进行热变性(95℃ 2 min)，冰中骤冷，待上机。
PCR实验技术指南之产物测序
1. DNA 直接测序：指直接分析不经分离的PCR 扩增产物，如果各个位点上碱基序列都是一致的，则所得信号是确定的，否则，在那些有相异碱基的位点出现模糊信号， 如果模板在多数情况下被正确扩增，则少数的突变将被掩盖，这是结果显示的是模板的序列.但是，当扩增的前几轮即出现错误扩增并被后续的循环积累，这时
DNA测序醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物
1. 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5 ml EP管中。 2. 加入25 μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10 min以沉淀DNA。12 000 r/min于4℃离心30 min，小心弃上清。 3. 加70%(V/V)的乙醇50 μl洗涤沉淀2次。12 000 r/min于4℃离
PCR产物克隆
克隆方法：1. 平端连接 通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条DNA链的3''''末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3'''&#
PCR产物克隆
克隆方法：1. 平端连接 通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条DNA链的3''末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3''突出一个碱基的DNA分子。这种DN
PCR产物克隆
PCR克隆主要有TA克隆法, 限制性酶切与连接法，杂交法和近期开发出来的特异性重组法等。但因为TA克隆法操作最简单，快速和高效的原因，成为Taq聚合酶PCR产物的最佳克隆方法。TA克隆法由Invitrogen发明，并拥有全球TA Cloning商标的ZL权。TA克隆方法（Original TA Cl
纯化测序反应产物实验
试剂、试剂盒 甲酰胺核酸寡核苷酸仪器、耗材 ABI PRISM 3100Genetic Analyzer微量离心管DTR Gel Filtration Cartridges (Edge Biosystems)或相应的真空浓缩仪实验步骤 一、材料1.缓冲液和溶液样品上样液所用的样品上样液取决于所用的设
纯化测序反应产物实验
试剂、试剂盒 甲酰胺 核酸 寡核苷酸 仪器、耗材 ABI PRISM 3100Genetic An
纯化测序反应产物实验
电泳之前纯化测序反应产物以去除多余的、尚未结合的染料终止子是非常必要的。离心柱可以是快速、有效地去除未结合的染料终止子。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。试剂、试剂盒甲酰胺核酸寡核苷酸仪器、耗材ABI PRISM 3100Genetic Analyzer微量离心管DTR
PCR产物的克隆
PCR 产物的克隆 PCR 产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。 平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的 PCR 产物直接进行连接。载体可用EcoR V 或 Sma I 切成平头； PCR 产物纯化后，可以在 22 ℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶
PCR－产物定量实验
测序之前对模板精确定量至关重要。根据 DNA 用量的多少，有几种不同的方法可供选择。下面介绍另外两种方法：荧光测定法和比较溴化物染色法。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。试剂、试剂盒DNA 标准TEPCR 产物仪器、耗材荧光计金属箔纸微量离心管实验步骤方法 A: 荧光测定
PCR－产物定量实验
试剂、试剂盒 DNA 标准 TE PCR 产物 仪器、耗材 荧光计 金属箔纸
PCR产物污染诱因
PCR反应的zui大特点是不仅具有较大扩增能力而且还有着极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。污染原因（1）标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，
PCR－产物定量实验
试剂、试剂盒 DNA 标准TEPCR 产物仪器、耗材 荧光计金属箔纸微量离心管实验步骤 方法 A: 荧光测定法荧光测定法可以在纳克级范围精确定量。荧光计和 DNA 定量试剂盒许多公司都有出售。确定荧光计是否安装了适合于特定染料的激发和发射的部件至关重要。该方法在设计上适用于配有带蓝色 LED
PCR产物的克隆
PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR 产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR 产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求
PCR产物纯化方法
Purification of PCR Products in Preparation for CloningJoseph SambrookPeter Maccallum Cancer Institute and The University of Melbourne, AustraliaDavid
PCR－产物纯化实验
介绍一个采用 AmiconMicrocon-PCR 滤件（Millipore) 的方法，有效地去除冗余dNTP 和引物的方法纯化 PCR 产物。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。试剂、试剂盒TE 或去离子水PCR 产物仪器、耗材离心机和转子PCR 滤 件微量离心管实验步骤
PCR－产物纯化实验
试剂、试剂盒 TE 或去离子水 PCR 产物 仪器、耗材 离心机和转子 PCR 滤 件
PCR－产物纯化实验
试剂、试剂盒 TE 或去离子水PCR 产物仪器、耗材 离心机和转子PCR 滤 件微量离心管实验步骤 一、材料1. 缓冲液和溶液TE(lOmmol/L Tris-HCl，lmmol/L EDTA，pH7.5) 或去离子水2. 核酸和寡核苷酸待测序的 PCR 产物3. 离心机和转子带有固定倾角转子的小型
PCR产物的克隆
PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。 平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求
PCR产物克隆方法
平端连接 通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条 DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由
简述PCR－产物纯化
PCR 反应完成目标 DNA 的扩增后，PCR 产物可以用于进一步的研究，例如用于 DNA 测序、克隆、分析基因的功能和表达等。然而，通过 PCR 反应后体系中仍然存在具有活性的 DNA 聚合酶，剩余的 dNTP、引物以及反应缓冲体系中的各种金属离子等。因此，我们必须通过一定的方法从反应体系中提纯
PCR产物保存时间
未纯化的PCR产物-20℃放上一周没有什么问题。纯化后若以干粉状态可在-20℃保存好几个月，若溶于Tris可保存一两个月。注意不要用纯水溶解。
PCR技术（十）：PCR产物克隆方法
平端连接 通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效 率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能 在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为 3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR
DNA测序PCR测序反应
1. 取0.2 ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂： 所加试剂 测定模板管 标准对照管 BigDye Mix 1 μl 1 μl 待测的质粒DNA 1 μl － pGEM-3Zf (+) 双链DNA － 1 μl 待测DNA的正向引物 1 μl － M13(
PCR产物电泳结果分析
基因组样品的模板量摸一个浓度吧，这个模板浓度不太合适。PCR产物以smear的形式出现，要么是样本降解，要么就是完全没有特异的扩增。要通过PCR筛选基因敲除的小鼠，最基本的要求就是引物特异性好，扩增效率高。不然没法筛选的。如果这对引物之前筛选过，你可以换换模板，重新合成下引物就行，如果完全没有用于筛
PCR产物的电泳检测
PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。常见问题如下： 一、假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板
PCR产物的直接纯化
实验概要本实验介绍了PCR产物直接纯化的原理及操作步骤。实验原理PCR产物一般都含有过量的引物、Taq DNA酶及dNTP，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程，因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多，商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。本实验中