PCR技术（十）：PCR产物克隆方法
平端连接 通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效 率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能 在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为 3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR 产物的效率通过较高，。在采用大量T4DNA连接酶并配以5—10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。对于较短PCR产物，用PUS19 的HincⅡ位点进行克隆，以X－gal和IPTG筛选，常可得到足量重组 子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶 消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法 克隆PCR产物。 粘端连接 引物中设计入限制酶位点：由于PCR引物的5'末端可以增加一些非 互补碱基，因此可以在两引物的5'末端设计单限制酶或双限......阅读全文
PCR产物纯化方法
Purification of PCR Products in Preparation for CloningJoseph SambrookPeter Maccallum Cancer Institute and The University of Melbourne, AustraliaDavid
PCR扩增产物克隆的实验要点
引物设计主要是要注意以下几个事项： （1）发夹结构； （2）反向配对； （3）GC含量（40－60%）； （4）退火温度（45－65度）； （5）引物长度（18－27bp）； （6）3' 端最好是C、G（提高结合度）； （7）引物在序列中的错配位点。 大致就这几个方面，重要性
克隆PCR产物的最优条件是什么？
最佳插入片段:载体比需实验确定。1:1(插入片段:载体)常为最佳比,摩尔数比1:8或8:1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶,插入片段共10ul。室温保温1小时,或4℃过夜。在这2种温度下,缺T-凸出端的载体会自连,产生蓝斑。室温保温1
克隆PCR产物的最优条件是什么？
最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液，50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温
PCR产物常规纯化方法
大批量、廉价、用于测序的PCR产物纯化方法--PEG沉淀 最近，摸索了一下PEG沉淀PCR产物的方法，贴出来，与大家共享。 目的：探索一种方法，能将PCR产物大批量地、廉价地、纯度比较高地纯化出来，并且最好能去掉200bp以下的小片段DNA，用于DNA测序。 有文献和方法说，不同浓度的PEG能沉淀不
克隆化的PCR产物连入T载体
由 Taq DNA 聚合酶 PCR 扩增产生的带 3' 突出端为 A 碱基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 载体上，这种 T 载体有与 A 碱基互补的未配对 3' T 碱基（Holton and Graham 1991; Marchuk et al. 1991)。本实验来源「分子克
iPCR或混合PCR产物的SLIC亚克隆
实验概要SLIC（Sequence and Ligation Independent Cloning）是一种不依赖于基因序列和连接反应的高效基因克隆新方法，它可以实现体外同源重组反应中多个DNA片段在单一反应中的装配和单链的退火。实验步骤1. 用限制性内切酶处理2微克载体，使用QIAEX II凝胶提
克隆化的PCR产物连入T载体
实验方法原理 由 Taq DNA 聚合酶 PCR 扩增产生的带 3' 突出端为 A 碱基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 载体上，这种 T 载体有与 A 碱基互补的未配对 3' T 碱基（Holton and Graham 1991; Marchuk et al. 1991
克隆化的PCR产物连入T载体
实验方法原理 由 Taq DNA 聚合酶 PCR 扩增产生的带 3' 突出端为 A 碱基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 载体上，这种 T 载体有与 A 碱基互补的未配对 3' T 碱基（Holton and Graha
PCR扩增产物的克隆——平端连接法
PCR扩增产物的克隆可以：（1）获得目的DNA片段；（2）用于原核表达的研究；（3）广泛应用于分子生物学相关研究。实验方法原理平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用
PCR产物的克隆（平头连接和粘头连接）
PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR 产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR 产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求
关于克隆PCR产物的对照实验相关介绍
A）涂布未转化的感受态细胞。 如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。 B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。 例如，将1ug/ul质粒1:100稀释，1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，
PCR技术（九）：PCR扩增产物的电泳分析
凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种.一、琼脂糖凝胶电泳: 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和 鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度， 把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在 37℃下维持液体
PCR实验技术指南之产物测序
1. DNA 直接测序：指直接分析不经分离的PCR 扩增产物，如果各个位点上碱基序列都是一致的，则所得信号是确定的，否则，在那些有相异碱基的位点出现模糊信号， 如果模板在多数情况下被正确扩增，则少数的突变将被掩盖，这是结果显示的是模板的序列.但是，当扩增的前几轮即出现错误扩增并被后续的循环积累，这时
PCR技术应用十：HIV感染
八十年代以来由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染而引起的艾滋病(AIDS)因其严重的危害性而受到人们高度重视，力争早期诊断和寻求有效治疗是防止其广泛传播的关键所在.聚合酶链反应(PCR)具有敏感、特异和快速的特点，是检测病毒、评价病情进展和探讨发病机理的有效工具.一、HIV的基因结构 HIV的基因
PCR产物的检测方法有哪些
1.琼脂糖凝胶电泳同时点分子量marker，根据marker条带判断产物分子量大小，从而大致判断是不是你要的2.酶切已知你产物的序列，看上面有什么酶切位点，用一个酶或者两个酶切断，看与理论预测的条带数目和大小是否一致。一般检测有以上两步就行了，如果需要知道确切的需要进行33.测序连接到pMD-18t
实验分析方法PCR扩增产物
孔板夹心杂交法： 该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特 异杂交使产物的间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素 等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一特异性较一次 杂交，漂洗后显色即可判断结果。该法需要两个杂交过程来检测 一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法
PCR扩增产物的分析方法
扩增产物的测定有各种方法,如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等,但临床PCR检验项目基本上都使用探针杂交方法。杂交结果不充分的原因可能是基因探针不合适、标记方法不对、对探针的标记不够、杂交或洗涤方法不合适等。最常使用的基因探针有:DNA片段、合成的寡核苷酸和体外转录的反义R
PCR产物的检测方法有哪些
PCR产物的检测方法：琼脂糖凝胶电泳这是实验室最常用的方法，简便易行，只需少量DNA即可进行实验。其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时，由于泳动速度不同而被分离，经溴化乙锭（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子发出荧光而判定其分子的大小。 用于电泳检测PCR产物的琼脂糖浓度常为1%—2%，应
PCR产物的检测方法有哪些
PCR产物的检测方法：琼脂糖凝胶电泳这是实验室最常用的方法，简便易行，只需少量DNA即可进行实验。其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时，由于泳动速度不同而被分离，经溴化乙锭（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子发出荧光而判定其分子的大小。 用于电泳检测PCR产物的琼脂糖浓度常为1%—2%，应
PCR－产物纯化实验
介绍一个采用 AmiconMicrocon-PCR 滤件（Millipore) 的方法，有效地去除冗余dNTP 和引物的方法纯化 PCR 产物。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。试剂、试剂盒TE 或去离子水PCR 产物仪器、耗材离心机和转子PCR 滤 件微量离心管实验步骤
PCR－产物定量实验
测序之前对模板精确定量至关重要。根据 DNA 用量的多少，有几种不同的方法可供选择。下面介绍另外两种方法：荧光测定法和比较溴化物染色法。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。试剂、试剂盒DNA 标准TEPCR 产物仪器、耗材荧光计金属箔纸微量离心管实验步骤方法 A: 荧光测定
PCR产物污染诱因
PCR反应的zui大特点是不仅具有较大扩增能力而且还有着极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。污染原因（1）标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，
PCR－产物定量实验
试剂、试剂盒 DNA 标准TEPCR 产物仪器、耗材 荧光计金属箔纸微量离心管实验步骤 方法 A: 荧光测定法荧光测定法可以在纳克级范围精确定量。荧光计和 DNA 定量试剂盒许多公司都有出售。确定荧光计是否安装了适合于特定染料的激发和发射的部件至关重要。该方法在设计上适用于配有带蓝色 LED
PCR－产物纯化实验
试剂、试剂盒 TE 或去离子水PCR 产物仪器、耗材 离心机和转子PCR 滤 件微量离心管实验步骤 一、材料1. 缓冲液和溶液TE(lOmmol/L Tris-HCl，lmmol/L EDTA，pH7.5) 或去离子水2. 核酸和寡核苷酸待测序的 PCR 产物3. 离心机和转子带有固定倾角转子的小型
PCR－产物纯化实验
试剂、试剂盒 TE 或去离子水 PCR 产物 仪器、耗材 离心机和转子 PCR 滤 件
PCR－产物定量实验
试剂、试剂盒 DNA 标准 TE PCR 产物 仪器、耗材 荧光计 金属箔纸
PCR产物保存时间
未纯化的PCR产物-20℃放上一周没有什么问题。纯化后若以干粉状态可在-20℃保存好几个月，若溶于Tris可保存一两个月。注意不要用纯水溶解。
简述PCR－产物纯化
PCR 反应完成目标 DNA 的扩增后，PCR 产物可以用于进一步的研究，例如用于 DNA 测序、克隆、分析基因的功能和表达等。然而，通过 PCR 反应后体系中仍然存在具有活性的 DNA 聚合酶，剩余的 dNTP、引物以及反应缓冲体系中的各种金属离子等。因此，我们必须通过一定的方法从反应体系中提纯
PCR技术应用基因克隆的应用
运用 PCR 技术、基因克隆和亚克隆比传统的方法具有更大的优点。由于 PCR 可以对单拷贝的基因放大上百万倍,产生微克(μg)级的特异 DNA 片段,从而可省略从基因组 DNA 中克隆某一特定基因片段所需要的 DNA的酶切、连接到载体 DNA 上、转化、建立 DNA 文库及基因的筛选、鉴定、亚克隆等