RTPCR一些心得
从RNA到电泳鉴定一、RT-PCR原理：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA 作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA 为模板，用VI 型胶原蛋白的α1 链的编码序列的特异性引物进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR 使RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA 样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA 探针、构建RNA 高效转录系统。 1）随机六聚体引物：当特定mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA 分子全部充当了cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA 中96%来源于rRNA。 2）Oligo(dT)：......阅读全文
RTPCR一些心得
从RNA到电泳鉴定一、RT-PCR原理：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA 作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA 为模板，用VI 型胶原蛋白的α1 链的编码序列的特异性引物进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR 使RNA
细胞污染的一些总结和心得
小生刚开始做细胞培养不久，对于一个细胞培养的新手来说，最怕的就是细胞受污染。所以本人翻阅了一些园子里的关于细胞培养过程中的污染问题的贴子，结合平时查阅资料以及这些天的细胞培养的一些心得，整理出一些关于细胞污染的东东与大家一起分享。希望能对刚踏入细胞培养的同仁们有些帮助，也希望各位达人作出补充，大家共
色谱柱一些使用心得分享
高效液相色谱仪是进行定量分析，杂质检查等分析工作中主要的精密仪器，色谱柱是液相色谱仪的zui核心部件。在这里，介绍一下使用中的注意事项及使用心得。 一、柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配 捷诺特色谱柱是消耗品，不是仪器原配的情况很多，如果接头和柱头深度匹配将会产生漏液或者死体积过大的现象。接
关于实验室数据可靠性的一些心得
关于实验室数据可靠性的一些心得
分享一些有关“弯曲试验机”使用心得，希望可以帮到你
弯曲试验机是对钢筋进行平面弯曲试验的测试设备，该设备主要技术参数和指标符合GBT1499.2-2018钢筋混凝土用钢第2部分和YB/T5126-2003《钢筋混凝土钢筋弯曲和反向弯曲试验方法》代替为钢厂和建筑单位检验螺纹钢筋反弯性能不可缺少的实验设备，同时适用于建筑行业现场钢筋弯曲，达到试验与施工
定量RTPCR－（Quantitative－RTPCR）
Application: Quantitative RT-PCR is used to quantify mRNA in both relative and absolute terms. It can be applied for the quantification of mRNA expres
ＷＥＳＴＥＲＮ－ＢＬＯＴＴＩＮＧ心得
蛋白提取：１． 总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）： 组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清.Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加)7.4mg/ml P
MTT实验心得
MTT实验是检测细胞活力的实验方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此也常常用来检测细胞的增殖情况。MTT的原理：活细胞有琥珀酸脱氢酶，将MTT还原成棕褐色沉淀。由于一般介绍园子里已经很多，笔者将自己的心得按照实验流程与大家交流交流。1、培养好细胞点板。养细胞没啥好说的，如果不知道细胞如何养，那就看
Realtime－PCR实验心得和RNA提取心得
并不是所有的实验都可以做real－time的，技术路线要选好当你的基因表达量少或有些不表达具体就是做普通pcr跑胶条带比较弱，不是很亮的情况下个人觉得最好不要选择real，不容易做好，特别是融解曲线用sbgr green染料做的话，引物设计时扩增片断最好小于250bp，太长了不好扩预实验先rt－pc
western－blot试验心得
前两天做了一个western blot,现在把试验中的一点小小的体会发上来，与大家交流，希望大家多多指点！1 本实验室采用的脱脂奶粉已经存放了近两年了，虽然是四摄氏度保存，但是其封闭质量还是难以保证的。所以本人的试验结果中出现了小斑点。建议最好使用BSA或专用的脱脂奶粉进行封闭，虽然贵点，但还是有个
酶切反应心得
一、 建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用
核酸抽提心得
最糟糕的心态 - 实验失败了，抱怨试剂不好。实验人员本来是应该拥有修正主义、机会主义、怀疑论等诸多“不完美的”意识，所以一定要用“完美的”自我批评意识来平衡。我为什么没有一双慧眼选择可靠的供应商？我为什么不做预实验检测所购试剂？最糟糕的知识 - RNase A 的作用。RNase A 是内切酶，内切
ChIP－新手心得
最近有不少战友在做ChIP实验，希望我的一点经验对大家有帮助（本贴不谈实验步骤，最后我会附件一份说明书，有详细步骤，另外建议像我一样的新手用试剂盒，避免不必要的麻烦）一、原理转录从基因的启动子区开始，由一系列的转录因子结合到基因的启动子区，通用转录因子结合在基本启动子区起始转录，而这个过程对基因的转
3’RACE－实验心得
引子：从06年12月份开始，断断续续做了一个多月的3’RACE，有了一些心得和体会。期间看了很多前辈们分享的经验，受益匪浅。在这里，我就自己的经历略作总结，希望能给像我一样的新人们有点启示，少走些弯路，不当之处欢迎指正。一、试剂盒的选择：3’RACE从原理上就能明白，它比5’RACE 要容易得多，所
半定量RTPCR－（SemiQuantitative－RTPCR－）
RT-PCR AnalysisSolutions10X RT Buffer10X PCR Buffer100 mM Tris pH 9.0500 mM KCl1% Triton X-10025 mM MgCl2use at a concentration of 1.5 mMLysis Solutio
Standard－RTPCR
RT-PCR or reverse transcription PCR refers to PCR that uses product of an RT reaction as template. In effect, the PCR amplifies cDNA fragments. In one
RTPCR步骤
总RNA提取1. 取200mg组织，放到1.5ml EP管中，加入1ml Trizol剪碎。2. 震荡30s。3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。4. 12000×g，4℃ 离心，15min。5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。6. 加等体积异丙醇，-20℃，3
RTPCR之我见
本文讨论的范围包括RNA酶保护分析，northernblot，原位杂交，半定量RT-PCR和定量RT-PCR。本文不谈具体protocol，是因为各种书籍和kit说明书上都有，主要说一些原则，而且大部分是失败和成功的经验，还有小组讨论结果以及各种书里七零八落看的内容，希望对大家有用。 基因表达的定义
RTPCR－PROTOCOL
RT-PCR PROTOCOL材料与方法………………………………………………………… 1．材料 ………………………………………………………1.1 供试用组织(细胞)…………………………………1.2 主要仪器设备………………………………………1.3 主要试剂……………………………………………1.
色谱柱保养心得
今天有人问我，《色谱柱使用记录》表里样品进样针数后面为什么还有个累计进样针数？ 套用哲学观点，任何物质都是有寿命的，大到宇宙，小到原子，但是不同的物质寿命是不一样的。 每一根色谱柱都有一个大致的进样针数寿命，理论上可以有一个规定，达到进样多少针，就强制报废。不过好像并没有这样的规定，那么也可
我作NORTHERN的心得
我们试验室作NORTHERN的一些总结，欢迎指正，谢谢。Northern杂交准备物品：50ml量筒1个 100ml量筒1个 300ml烧杯1个 250ml 烧杯1个 250ml的锥形瓶1个 10ml 离心管2个 大小盘各1个 镊子1把 剪刀1把 DEPC水500ml 2，瓶玻璃棒1根 电泳槽、转膜槽
心得安临床新用
心得安系β－肾上腺素能受体阻滞剂，用于临床已有40余年，以往主要用于治疗心律失常、心律增快、高血压、心肌梗死、心绞痛和嗜铬细胞瘤等。 经临床实践，发现该药的还有其它用途，现分别介绍如下。 1.甲亢 心得安治疗甲亢早有报道。因它能阻断β－受体，用药后可使心律减慢、心肌收缩力和房
色谱柱保养心得
每一根色谱柱都有一个大致的进样针数寿命，理论上可以有一个规定，达到进样多少针，就强制报废。不过好像并没有这样的规定，那么也可以作为一个参考，当色谱柱的柱性能参数（就是常说的理论塔板数、分离度、拖尾因子等等）不达标时，参照进样针数判断是柱子寿命到了，属于不可逆因素，只能换柱子。还是其它原因，如流动
RTPCR技术简介和RTPCR引物的选择
RT-PCR简介RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cD
什么是RTPCR，RTPCR的定义与检测方法？
1.定义：是以RNA为模板，联合逆转录反应（reverse transcription，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。 RNA扩增包括两个步骤： 在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA；加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火
RTPCR经验浅谈
RT-PCR成败的关键首先在于RNA模板的制备以问者的口气应该是做RNA病毒基因的RT-PCR本人三年前做过一个正链RNA病毒全基因组分段扩增设计方案是将全基因组分成7个片段，0.6kb-3.3kb不等分别进行RT-PCR扩增刚开始的三个月我们课题组三个人辛辛苦苦什么招都想过了结果连一个片段都没有拿
实时－RTPCR－实验
试剂、试剂盒 RNA 模板 DNA 酶缓冲液 DNA 酶 I DEPC 处理的水 oligo(dT) MgCl2 dNT
RTPCR实验流程
1、技术原理实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时检测整个PCR进程，zui后通过Ct值与标准曲线的处理对未知样本进行定量分析，是zui常用的基因表达分析技术。有绝对定量与相对定量两种定量分析方法。 图 各种荧光定量曲线示意图2、服务流程及质控2.1 实验流程样本
RTPCR技术2
三：操作１：反转录反应按下表准备反应液样品 体积 终浓度５×反应缓冲液 10μl １×dNTP混合液 1μl 0.2mM下游引物 50pmol* 1μm上游引物 50pmol* 1μm25mM MgSO4 2μL 1mMAMV反转录酶 1μl 0.1μ/μlTflDNA聚合酶 1μl 0.1μ/μl
RTPCR经验浅谈
做RNA病毒基因的RT-PCR成败的关键首先在于RNA模板的制备。本人三年前做过一个正链RNA病毒全基因组分段扩增，设计方案是将全基因组分成7个片段，0.6kb-3.3kb不等，分别进行RT-PCR扩增，刚开始的三个月，我们课题组三个人辛辛苦苦，什么招都想过了，结果连一个片段都没有拿到。后来有一个周