半定量RTPCR（SemiQuantitativeRTPCR）
RT-PCR AnalysisSolutions10X RT Buffer10X PCR Buffer100 mM Tris pH 9.0500 mM KCl1% Triton X-10025 mM MgCl2use at a concentration of 1.5 mMLysis Solution4M GuSCN 250 g guanidine thiocyanate25mM Na citrate 7.0 17.6 ml 0.75M Na citrate pH 7.00.5% Sarkosyl 26.4 ml 10% Sarkosyladd 293 ml Qbefore use, add 72ml bMEbME added just prior to use. If collecting several samples hold tubes on ice. These can be s......阅读全文
半定量RTPCR－（SemiQuantitative－RTPCR－）
RT-PCR AnalysisSolutions10X RT Buffer10X PCR Buffer100 mM Tris pH 9.0500 mM KCl1% Triton X-10025 mM MgCl2use at a concentration of 1.5 mMLysis Solutio
定量RTPCR－（Quantitative－RTPCR）
Application: Quantitative RT-PCR is used to quantify mRNA in both relative and absolute terms. It can be applied for the quantification of mRNA expres
相对－RTPCR:－样品定量实验
试剂、试剂盒 双蒸水 RT-PCR 缓冲液 MMLV 逆转录酶 SUPERaseINRNA 酶抑制剂 Taq DNA 聚合酶 总 RNA
相对－RTPCR:－样品定量实验
已知线性范围的循环参数和 18SrRNA 引物与竞争子的比例，就可以用自己的样品去做相对定量 RT-PCR。下面配制的 PCR 反应混合物包含 9 个反应（4 个样品、4 个非反转录对照、1 个不加模板的对照）及 10% 的额外份额。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。试剂
相对－RTPCR:－样品定量实验
试剂、试剂盒 双蒸水RT-PCR 缓冲液MMLV 逆转录酶SUPERaseINRNA 酶抑制剂 Taq DNA 聚合酶总 RNA 随机引物dNTP 混合物 基因特异的正向引物基因特异的反向引物[a-32P]dCTP仪器、耗材 Quantu mRNA Universal 18S standards P
microRNA的实时定量茎环RTPCR技术
microRNA的实时定量茎环RT-PCR技术 摘要： 已开发出一种新型的microRNA（miRNA）的定量方法，即利用茎环反转录，Taqman PCR分析。茎环RT引物在RT 效率和特异性方面比传统的更好。TaqMan miRNA的检测是很具体的，可以检测成熟miRNA和区分
RTPCR－PROTOCOL
RT-PCR PROTOCOL材料与方法………………………………………………………… 1．材料 ………………………………………………………1.1 供试用组织(细胞)…………………………………1.2 主要仪器设备………………………………………1.3 主要试剂……………………………………………1.
Standard－RTPCR
RT-PCR or reverse transcription PCR refers to PCR that uses product of an RT reaction as template. In effect, the PCR amplifies cDNA fragments. In one
RTPCR之我见
本文讨论的范围包括RNA酶保护分析，northernblot，原位杂交，半定量RT-PCR和定量RT-PCR。本文不谈具体protocol，是因为各种书籍和kit说明书上都有，主要说一些原则，而且大部分是失败和成功的经验，还有小组讨论结果以及各种书里七零八落看的内容，希望对大家有用。 基因表达的定义
RTPCR步骤
总RNA提取1. 取200mg组织，放到1.5ml EP管中，加入1ml Trizol剪碎。2. 震荡30s。3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。4. 12000×g，4℃ 离心，15min。5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。6. 加等体积异丙醇，-20℃，3
RTPCR技术简介和RTPCR引物的选择
RT-PCR简介RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cD
microRNA的实时定量茎环RTPCR技术（四）
图5。对热处理细胞，细胞裂解液和10 miRNA实时定量总RNA进行比较。用阈值循环（CT）来衡量miRNA的表达水平。每PCR扩增约400 HepG2细胞进行了分析。 图6。的TaqMan miRNAmiR-16的分析比较来解决以印迹杂交为基础的分析。总RNA来自小鼠肾，肝，肺，脾和睾丸组织。
microRNA的实时定量茎环RTPCR技术（二）
图1。上图描述的是TaqMan miRNA的检测原理，基于TaqMan实时定量miRNA的包括两个步骤，茎环RT和实时PCR。茎环RT引物结合在miRNA分子的3'端和用反转录酶逆转录。然后，RT产品使用传统的TaqMan PCR定量，其中包括特定miRNA的正向引物，反向引物和
microRNA的实时定量茎环RTPCR技术（五）
TaqMan miRNA的检测能力不同，是依据采用let-7a, let-7b, let-7c, let-7d 和let-7e 5个合成miRNA来检测低至一个核苷酸（图7）。每个miRNA的检测对应每个miRNA。相对探测效率是通过计完全匹配和不匹配的目标CT之间的差异，假设完美匹配的效率为1
microRNA的实时定量茎环RTPCR技术（三）
评估RNA分离的需要，我们直接在miRNA的检测中增加了细胞裂解物。相当于直接在7.5毫升逆转录反应中添加2.5-2500细胞。当检测到，在一些细胞中CT值相关R2>0.998）的RT反应至少有三个数量级（图4）。 图3。总RNA输入的阈值循环（CT）值检测8个miRNA的相关性。每RT反应中，小鼠
microRNA的实时定量茎环RTPCR技术（一）
摘要：已开发出一种新型的microRNA（miRNA）的定量方法，即利用茎环反转录，Taqman PCR分析。茎环RT引物在RT 效率和特异性方面比传统的更好。TaqMan miRNA的检测是很具体的，可以检测成熟miRNA和区分相关的甚至低至一个核苷酸的miRNAs。此外，他们不会受到基因组DNA
实时荧光定量RTPCR的Fold－change怎么计算
3. Real-time qPCR定量方法可以分为绝对定量和相对定量。绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。相对定量可以分为比较Ct
什么是RTPCR，RTPCR的定义与检测方法？
1.定义：是以RNA为模板，联合逆转录反应（reverse transcription，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。 RNA扩增包括两个步骤： 在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA；加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火
Protocol－for－competitive－RTPCR
For quantifying mRNA, we use a competitive RT-PCR protocol with internal standard RNAs. These are added in a defined quantity to the RNA sample prior
RTPCR的原理
原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。RT- PCR（Re
RTPCR实验流程
1、技术原理实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时检测整个PCR进程，zui后通过Ct值与标准曲线的处理对未知样本进行定量分析，是zui常用的基因表达分析技术。有绝对定量与相对定量两种定量分析方法。 图 各种荧光定量曲线示意图2、服务流程及质控2.1 实验流程样本
实时－RTPCR－实验
试剂、试剂盒 RNA 模板 DNA 酶缓冲液 DNA 酶 I DEPC 处理的水 oligo(dT) MgCl2 dNT
实时－RTPCR－实验
试剂、试剂盒 RNA 模板DNA 酶缓冲液 DNA 酶 IDEPC 处理的水oligo(dT)MgCl2 dNTPEDTA实验步骤 —、材料1. 缓冲液、溶液和试剂①10ul 消化体系的组分。RNA 模板（最多 1ug/10ul) xul10X
RTPCR经验浅谈
RT-PCR成败的关键首先在于RNA模板的制备以问者的口气应该是做RNA病毒基因的RT-PCR本人三年前做过一个正链RNA病毒全基因组分段扩增设计方案是将全基因组分成7个片段，0.6kb-3.3kb不等分别进行RT-PCR扩增刚开始的三个月我们课题组三个人辛辛苦苦什么招都想过了结果连一个片段都没有拿
实时－RTPCR－实验
本方法使用Superscription反转录系统合成cDNA。进行实时PCR时，FAM或JOE荧光基团既可以标记正向引物，也可以标记反向引物。可以用Trizol试剂提取RNA或按第10章描述的方法提取RNA。样品中的基因组DNA用DNaseI消化掉（参照第10章）。本实验来源于PCR实验指南（第二版
RTPCR技术1
目前已有多种方法用来研究有关细胞和组织中，基因表达产物方面的内容，这些方法主要有Northern印迹、RNase保护分析法、原位杂交、点印迹、Ｓ１核酸酶分析法及反转录与PCR扩增串联的RT-PCR技术等。在这些方法中RT-PCR技术具敏感度高和应用范围广的特点，该技术提供给研究人员有效的进行测定转录
RTPCR实验步骤
实验材料：水稻叶片的 RNA 。实验原理：目前 PCR 技术只能扩增 DNA 模板，对 RNA 模板不能直接扩增。mRNA反转录生成的 cDNA 可作为 PCR 的模板进行扩增，这种在 mRNA 反转录后进行的 PCR 扩增称为 RT-PCR 。 RT-PCR 比 Northern 杂交更灵敏，对
RTPCR经验浅谈
做RNA病毒基因的RT-PCR成败的关键首先在于RNA模板的制备。本人三年前做过一个正链RNA病毒全基因组分段扩增，设计方案是将全基因组分成7个片段，0.6kb-3.3kb不等，分别进行RT-PCR扩增，刚开始的三个月，我们课题组三个人辛辛苦苦，什么招都想过了，结果连一个片段都没有拿到。后来有一个周
RTPCR技术2
三：操作１：反转录反应按下表准备反应液样品 体积 终浓度５×反应缓冲液 10μl １×dNTP混合液 1μl 0.2mM下游引物 50pmol* 1μm上游引物 50pmol* 1μm25mM MgSO4 2μL 1mMAMV反转录酶 1μl 0.1μ/μlTflDNA聚合酶 1μl 0.1μ/μl
RTPCR实验步骤
一、组织抽提：1. 取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末2. 移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆3. 移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打4. 冰上孵育5分钟5. 离心12,000g 4℃ 5分钟 取上清液移