蛋白纯化反相柱的选择
HP-RPC的选择首先要看蛋白质的分子量，20kDa左右的一般用C4或C8，再小一点的可以用C18，太大的蛋白并不适于反相分离。C18通用性最好，但是有时候保留过强可能会导致收率较低。如果目的蛋白不是很针对，可以考虑通用性最强的C18柱。一般来说，4.6mm的内径比较常见，250mm长的柱子比150mm的柱子分离度要好，无论对小肽还是蛋白都是这样。其次要注意填料的孔径，80A左右的填料主要是用于小分子的分析分离，对于蛋白这样的大分子，要用300A孔径的填料，可以避免分子扩散到填料内部的摩擦阻力，提高柱效。此外C载量来说，蛋白柱和一般的C18也是不一样的。Agilent, Waters，Vydac都有相关的成熟产品，最好能配备相应的保护柱。更小内径的柱子可以节省流动相，有些更适于甲酸等液质连用的情况。制备的话，还是考虑聚合物的制备级填料Source RPC比较好，可以NaOH CIP。Amersham也有ReSource的聚合物反......阅读全文
蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南（四）
柱内径由于样品容量很低，纯化过程很少使用小孔柱（内径小于2mm）。小规模实验室纯化采用细孔柱（内径约2mm）和分析柱（4.6 mm内径）。这种小规模制备分离的色谱条件通常与分析分离的色谱条件相同。需要大量蛋白质/多肽时，采用10mm和22mm内径的柱子。1 mg蛋白质或多肽的纯化可采用10 mm柱子
蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南（五）
二硫键测定蛋白质依靠正确的二硫键键合维持其三级结构和生物活性。如果二硫键被还原或交换，则蛋白质会失去天然三级结构和生物活性。HPLC保留值取决于蛋白质“疏水脚”的大小（图41），它会受到三级结构的影响。二硫键的改变通常会使“疏水脚”增大，从而使蛋白质在反相HPLC中的保留值增大。图42中，天然白细胞
蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南（六）
蛋白质在高温或高pH值下会降解。在胁迫条件下，最有可能发生的化学降解是酰胺侧链上的天冬酰胺转变为天冬氨酸或异天冬氨酸（图37)。天冬酰胺脱去酰氨基时，许多蛋白都会失去生物活性，但也有部分蛋白的生物活性不受影响。即使脱酰胺作用不造成生物活性的减弱，脱酰胺作用也是蛋白接触不利条件的指示。特定天冬酰胺残基
蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南（七）
在氧化环境条件下，尽管蛋白质的几个氨基酸都可能受影响，但最有可能被氧化的氨基酸是甲硫氨酸；甲硫氨酸可被氧化成甲硫氨酸亚砜（图34）。对甲硫氨酸残基的氧化取决于其在蛋白质中的位置。埋藏在蛋白质内部的甲硫氨酸不可能被氧化。接近表面且与溶剂接触的甲硫氨酸侧链最有可能被氧化。氧化条件包括热、过渡金属的存在以
蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南（八）
肽图分析法 - 蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南反相高效液相色谱已成为蛋白质分析和表征的标准方法，尤其是治疗性药物的分析和表征。反相色谱分析法分辨率高，检测灵敏度好，能够提供大量关于蛋白质的信息。有些时候，蛋白质作为完整的分子分析，但更多的时候采用蛋白水解酶作用于特殊的氨基酸残基将碳骨架断开，
蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南（十一）
HPLC-MS 联用的两个重要因素是电喷射接口的最佳流速及三氟乙酸对肽电离的影响 基本电喷雾接口的信号在5~10μL/min的流速区间上迅速下降（图28）。这与采用标准分析型HPLC柱的流速不相容。目前，商用电喷雾提供一种高剪切流氮气辅助的电喷雾（气流辅助电喷雾），它将电喷雾的最佳流速区间提升到了2
蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南（十五）
其它离子对试剂。尽管目前为止TFA仍是最常用的离子对试剂，但蛋白质/多肽分离有时会采用磷酸和七氟丁酸（HFBA）等其它试剂。 如图18所示，一些情况下，磷酸可分离一些TFA无法分离的多肽。通常磷酸盐使用浓度约为20-30 mM，pH为2~2.5。此外，磷酸盐缓冲液对一些蛋白质的分离效果要优于TFA。
蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南（一）
蛋白质组学蛋白质组学是鉴定和定量细胞、组织或生物体蛋白质的科学，目的是了解生物学变化和疾病状态，开发疾病的生物标记和治疗药物的靶点。如果将一个基础蛋白的各个修饰蛋白算作一个蛋白，那么哺乳动物细胞含多达3~4万个蛋白。当计算各个修饰后的蛋白时，蛋白质的数量远远超过了10万。细胞内不同蛋白质的丰度或浓度
蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南（三）
蛋白质纯化RP-HPLC 是一种有效的蛋白质/多肽纯化工具。通过 RP-HPLC 法可以从杂质中分离目标蛋白/多肽，采集到的片段可用于进一步研究，以及借助正交分析技术的分析，甚至可作为治疗药物。在蛋白质/多肽分析过程中，色谱条件优化的目标是优化分辨率和保留时间。制备色谱法分离蛋白质/多肽时，色谱条件
如何挑选Flash纯化柱之选择合适的固定相
固定相也就是俗称的填料，是色谱中zui为核心的部分。要确定Flash纯化柱装填的固定相，就要依次确定固定相三个方面的信息：基质种类、表面修饰/键合相、基质参数。一、基质基质是固定相构成的基本材料，常用的基质材料分为三大类：无机材料、有机材料以及复合材料。无机材料有：硅胶、氧化铝等；有机材料主要是凝胶
如何挑选Flash纯化柱之选择合适的固定相
Flash纯化柱是Flash纯化体系的心脏，好比汽车里的发动机。工欲善其事，必先利其器，挑选正确的Flash纯化柱是整个纯化最为关键的一环。而挑选合适的Flash纯化柱就像茫茫的人海中挑选另一半一样，高矮胖瘦、外貌、内涵品质各方面都要细细斟酌考虑。今天我们就聊聊纯化柱的内涵——固定相。图1. 常州三
镍柱纯化蛋白后，镍柱上的咪唑用除去吗
ni柱中的氯化镍可以与有his（组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合。步骤是：过柱子前可以选择ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行了，然后平衡柱子，拿你自己的buffer，给蛋白提供最适的环境，我一般平衡4个柱长，然后蛋白上样，你可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太
镍柱纯化蛋白后，镍柱上的咪唑用除去吗
财大气粗到只用一次的话，就不用去除了。如果和我做学生时一样，一定要去除哦。先用纯化buffer，再用无菌水，再用20%乙醇。
镍柱纯化蛋白后，镍柱上的咪唑用除去吗
ni柱中的氯化镍可以与有his（组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合。步骤是：过柱子前可以选择ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行了，然后平衡柱子，拿你自己的buffer，给蛋白提供最适的环境，我一般平衡4个柱长，然后蛋白上样，你可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太
反相色谱柱的平衡方法
聚合物基质的反相色谱柱采用了聚甲基丙烯酸酯聚合物，制备而成具有不同孔径和粒径大小的各种规格的产品。TSKgel 聚合物基质反相色谱柱适用于较宽的pH范围，即使在高pH下也具有很好的重复性。这类色谱柱在pH2-12下表现出极其稳定的化学特性。因此，在硅胶基质色谱柱适用受限的碱性pH下仍然可以使用。
反相色谱柱的影响因素
液相色谱柱通常分为正相柱和反相柱。正相色谱柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相色谱柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料
反相色谱柱的平衡方法
反相色谱柱的平衡方法 聚合物基质的反相色谱柱采用了聚甲基丙烯酸酯聚合物，制备而成具有不同孔径和粒径大小的各种规格的产品。TSKgel 聚合物基质反相色谱柱适用于较宽的pH范围，即使在高pH下也具有很好的重复性。这类色谱柱在pH2-12下表现出极其稳定的化学特性。因此，在硅胶基质色谱柱适用受限的
反相色谱柱效能评价
一、反相色谱柱评价条件 对于一根填充柱来说，最基本的柱性能评价指标是柱效和峰对称的测定。反相色谱柱评价所需常用的流动相一般是甲醇或者乙腈与水的体系，对于含有酸碱性组份的样品，流动相为甲醇或者乙腈与缓冲盐的体系；检测波长一般在254nm下检测，因为在此波长处，甲醇、乙腈，磷酸缓冲
反相萃取柱操作
反相萃取柱操作从极性基体中提取非极性的样品1、活化:以3-5毫升甲醇淋洗萃取柱;以3-5毫升去离子水(或缓冲液)淋洗萃取柱并保持萃取柱湿润2、上样:以合适的流速使样品均匀通过萃取柱3、清洗:以5毫升适当极性的溶剂洗脱吸附样品的萃取柱(常用的有纯水,缓冲液,水/有机溶剂混合液)4、洗脱:将被测样品,用
什么是反相色谱柱
固定相为非极性的色谱柱。在反相键合相色谱中，溶剂的极性越弱洗脱能力越强，即弱极性溶剂的洗脱强度更大
反相色谱柱效能评价
一、反相色谱柱评价条件对于一根填充柱来说，最基本的柱性能评价指标是柱效和峰对称的测定。反相色谱柱评价所需常用的流动相一般是甲醇或者乙腈与水的体系，对于含有酸碱性组份的样品，流动相为甲醇或者乙腈与缓冲盐的体系；检测波长一般在254nm下检测，因为在此波长处，甲醇、乙腈，磷酸缓冲盐均没有紫外吸收，而且标
色谱柱冲洗的那些事儿（反相色谱柱）
衣服穿久了要洗，色谱柱用久了要冲，不过冲洗色谱柱可不像洗衣服那么简单，到底该怎么洗，还是有些门道的：第一个问题：用什么冲1.1：什么叫冲洗色谱柱通常，色谱柱冲洗就是把色谱柱上的脏东西和对色谱柱有损坏的东西冲出来，并且保存在合适的溶剂中；还有另一种情况，也可以算作冲洗的范畴，就是梯度方法间重新平衡色谱
反相色谱柱与正向色谱柱的区别
倒置或法线相位是基于相对于固定相位的移动相位的极性。如果流动相的极性强于固定相，则称为反相色谱；如果流动相的极性弱于固定相，则称为正相色谱。反相色谱流动相极性强，易携带极性分子，留下非极性分子。主要用于非极性样品的分离。常用的高压液相色谱就是这样，有些人喜欢说，反相液相色谱其实是一种意义，也就是说，
色谱柱冲洗的那些事儿（反相色谱柱）
衣服穿久了要洗，色谱柱用久了要冲，不过冲洗色谱柱可不像洗衣服那么简单，到底该怎么洗，还是有些门道的：第一个问题：用什么冲1.1：什么叫冲洗色谱柱通常，色谱柱冲洗就是把色谱柱上的脏东西和对色谱柱有损坏的东西冲出来，并且保存在合适的溶剂中；还有另一种情况，也可以算作冲洗的范畴，就是梯度方法间重新平衡色谱
镍柱纯化蛋白不挂住怎么办
有his标签么？要不就是beads的事？是你自己装的柱么？多长时间了？还有可能是你的蛋白构象变了，可能把his部分裹在里边了，找找别的条件，或者换NC端。
如何从正相柱换为反相柱
同一根柱子可以从正相转换为反相，反相高效液相色谱法只是高效液相色谱法的一个分支，用甲醇水做流动相代替正己烷就直接转换成了反相HPLC。
如何从正相柱换为反相柱
同一根柱子可以从正相转换为反相，反相高效液相色谱法只是高效液相色谱法的一个分支，用甲醇水做流动相代替正己烷就直接转换成了反相HPLC。
纯化柱的寿命
这是个非常常见的问题，很多老师习惯有个明确的使用时间，以便于实验室水系统的管理与维护。但是纯水纯化柱的寿命在普通的使用状态下是很难计算的，主要因为：①每个实验室的日常用水量差别大，这会导致纯化柱寿命有比较大的区别；②进水水质的优劣，直接影响了纯化柱的寿命。在确定填料性能和容量的条件下，水中污染的含量
蛋白质特性与分离纯化技术的选择
摘要：蛋白质的一级、二级、三级和四级结构决定了它的物理、化学、生物化学、物理化学和生物学性质，综述了不同蛋白质之间的性质存在差异或者改变条件是使之具有差异，利用一种同时多种性质差异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择蛋白质提纯的方法。关键词：蛋白质 分离纯化前言 蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂