非标记抗体酶法PAP法
PAP复合物是离体制备的HRP抗HRP复合物，它的制备方法较多，现简介其中之一。（1）制备抗HRP血清：健康雄性家兔（2．Okg以上），可先于足趾皮下注射灭活的卡介苗（共lOmg），2周后重复1次，刺激机体免疫系统功能，1周后于背部脊柱两旁皮内多点注射1．Oral乳剂[福氏完全佐剂，含HRP3。3mg（RZ＝3．0）L间隔2周第2次注射，背部注入含3．3mg HRP的不完全福氏佐剂1．0ml；再间隔2周，第3次注射，2mgHRP（溶于2ml生理盐水中），分别于前后小腿皮下和背部肌肉内多点注射，1周后采静脉血，检查效价。再隔1周第4次加强注射（条件同第3次），1周后检查抗体效价，琼脂糖扩散法（HRP 0．1mg／m1）为1：128以上时，颈动脉取血，制备血清低温保存备用。（2）制备PAP复合物：离体条件下，使兔抗HRP抗体与HRP形成可溶性复合物。在制备抗HRP血清时，HRP的纯度要高（RZ≥3），而制备PAP复合物时......阅读全文
非标记抗体酶法PAP法
PAP复合物是离体制备的HRP抗HRP复合物，它的制备方法较多，现简介其中之一。（1）制备抗HRP血清：健康雄性家兔（2．Okg以上），可先于足趾皮下注射灭活的卡介苗（共lOmg），2周后重复1次，刺激机体免疫系统功能，1周后于背部脊柱两旁皮内多点注射1．Oral乳剂[福氏完全佐剂，含HRP3。3m
非标记抗体免疫酶组织化学实验——PAP－法
实验方法原理与酶桥法相似，不同的是酶桥法分四步，而 PAP 法分三步。PAP 法将酶桥法的步骤（3）、步骤（4）合二并为一，用 PAP 复合物替代，故称 PAP 法（图 4-9）。PAP 复合物中的抗 HRP 抗体和第一抗体必须为同一种属动物的 IgG，这样桥抗体才能作为「桥」将 PAP 复合物连接
免疫酶标方法(直接法、间接法、PAP法和双PAP法)
一、直接法1．标本固定。2．PBS洗涤2×3分钟。3．1% H2O2（或1% H2O2 甲醇）抑制内源性过氧化物，室温10～20分钟。4．正常血清（1:10）孵育，室温20分钟。5．滴加酶标记的抗体37℃1小时或4℃过夜。6．PBS洗涤3×3分钟。7．DAB＋H2O2显色5～10分钟，镜下控制染色结
非标记抗体免疫酶组织化学实验——双－PAP－法
实验方法原理在 PAP 法的基础上重复第二抗体和 PAP 复合物，重复的连接抗体和 PAP 复合物可能有以下两种连接方式（图 4-10）。第一种（A）重复连接抗体可与一个 PAP 中的抗 HRP 抗体上未饱和的 Fc 段结合，再与后加的 PAP 复合物相结合；第二种（B）重复连接抗体与特异性一抗分子
免疫酶标技术——双PAP法
实验方法原理这种方法可在复合物体系中连接更多的PAP复合物，对抗原可进一步放大，因此灵敏度更为增强，适用于微量抗原的检测。实验材料抗体试剂、试剂盒PBSH2O2血清DAB苏木精仪器、耗材显微镜实验步骤1. 标本固定后，PBS洗涤；2. 1 %H2O2（或1 %H2O2甲醇）阻断内源性过氧化物，室
关于抗过氧化物复合物制备技术的简介
Stemberger(1970)等，首先报道了过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物（peroxidase-antiperoxidase,PAP）法，此法也称为非标记抗体酶法（unlabelled antibody enzymemethod）。PAP法不需用任何化学交联剂处理酶和抗体，二者活性不受化学反
免疫细胞化学技术的某些新进展
免疫细胞化学技术在继续改进和完善中，新的技术方法不断出现。除目前国内已开始应用的免疫金技术和免疫金银技术外，80年代，新的免疫细胞化学技术还有半抗原交联抗体法和令人瞩目的分子杂交免疫细胞化学技术。免疫金银技术和分子杂交免疫细胞化学技术将分别以专章 叙述，本节 仅就半抗原交联抗体法作一简要介绍。 【
随机引物法标记－DNA
实验方法原理 利用寡核苷酸作引物，DNA 聚合酶可沿单链模板起始 DNA 的合成（Gotilian 1969)。如果寡核苷酸的序列不均一，它们就可在模板的多位点上与模板杂交。因此模板上每一核苷酸（5' 端的核苷酸除外）的互补物将以同样的频率掺入产物。实验材料 大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ Kl
随机引物法标记探针
实验概要本实验探针标记采用TAKARA公司的随机引物标记试剂盒Ver.2。实验步骤1．于1.5ml离心管中加入5μl H2O，2μl引物(N6)，5μl DNA(0.1μg-1μg)。2．充分混匀，98°C 3分钟。3．离心1秒钟，将离心管盖上的汽化水甩下。4．加入2.5μl dNTPs(各2.5m
随机引物法标记－DNA
利用寡核苷酸作引物，DNA 聚合酶可沿单链模板起始 DNA 的合成（Gotilian 1969)。如果寡核苷酸的序列不均一，它们就可在模板的多位点上与模板杂交。因此模板上每一核苷酸（5' 端的核苷酸除外）的互补物将以同样的频率掺入产物。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。实验方法
随机引物法标记－DNA
实验方法原理 利用寡核苷酸作引物，DNA 聚合酶可沿单链模板起始 DNA 的合成（Gotilian 1969)。如果寡核苷酸的序列不均一，它们就可在模板的多位点上与模板杂交。因此模板上每一核苷酸（5' 端的核苷酸除外）的互补物将以同样
SPA－在免疫组化中的应用——PAP－法
SPA 可为多种示踪物（如荧光素、酶、胶体金、铁蛋白）所标记，应用较广泛的为酶标记 SPA 和金标记 SPA 技术。标记 SPA 常用的酶为 HRP，可应用于间接法染色，SPA 在 PAP 法中可代替桥抗体。实验方法原理SPA 除与标记物结合后用于代替第二抗体外，其本身可作为桥抗体用于 PAP 染色
FITC标记抗体Chadwick氏法
试剂：抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%重碳酸钠水溶液、pH8.0的0.01mol/L PBS、1%硫柳汞； 材料：离心机及离心管、三角烧瓶（25ml）、冰槽、无菌吸管及毛细滴管、透析袋、玻璃棒、棉线及烧杯（500ml）等； 方法与步骤：1. 抗体的准备。用0—4℃ pH8.0的PBS
FITC标记抗体Marsshall氏法
材料：抗体球蛋白溶液、0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶（25—50ml）、冰及冰槽（或1000ml烧杯）、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻璃棒、棉线及烧杯（500ml）、pH7.2或8.0的0.01mol/L PBS等； 方法
FITC标记抗体Marsshall氏法
材料：抗体球蛋白溶液、0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶（25—50ml）、冰及冰槽（或1000ml烧杯）、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻璃棒、棉线及烧杯（500ml）、pH7.2或8.0的0.01mol/L 等；方法与步骤：
FITC标记抗体Chadwick氏法
FITC标记抗体-Chadwick氏法试剂：抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%重碳酸钠水溶液、pH8.0的0.01mol/L 、1%硫柳汞；材料：离心机及离心管、三角烧瓶（25ml）、冰槽、无菌吸管及毛细滴管、透析袋、玻璃棒、棉线及烧杯（500ml）等；方法与步骤：抗体的准备。用0—4℃ pH8.
FITC标记抗体改良法
FITC标记抗体-改良法 试剂： 1.0.01mol/L pH7.2 配方。将NaCl 18g、Na2HPO4 1.15g、KH2PO4 0.2g， 溶于2000ml三蒸水中，调整pH至7.2； 2.0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液配法。量取0.5mol/L Na2CO3（5
抗体酶的杂交瘤技术制备法介绍
经体内免疫后再进行细胞融合是制备抗体酶的一种传统方法。杂交瘤技术的基本原理是用不能在培养液中生长的但能产生抗体的脾脏细胞，与能在培养液中生长的骨髓瘤细胞进行融合，融合得到的杂交细胞既能产生抗体又能在体外培养，通过选择培养，以获取能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。再把这些细胞单克隆化，即繁殖成母体的同
非标记抗体免疫电镜实验——快速法(琼脂扩散法)
实验方法原理标记抗体法虽然具有许多优点，但也存在一些难以克服的问题，如标记抗体的分子增大，对细胞膜和组织的穿透力减弱；化学交联反应对抗体和酶的活性有所影响；结合物中未标记的抗体可与抗原竞争结合，影响检测方法的敏感性等。不标记抗体法可以避免上述的不利影响因素，通过一系统的非标记抗体的免疫学反应，对组织
免疫酶细胞化学技术中的双PAP法检测微量抗原
在复合物体系中连接更多的PAP复合物，来进一步放大抗原，从而使灵敏度更为增强，适用于检测微量抗原。实验方法： 将固定后的标本用PBS漂洗；2. 于室温下用1%H2O2或1%H2O2甲醇浸泡涂片10~20min，用来密封内源性过氧化物酶；3. PBS漂洗2次，每次3min；4. 在室温下用二抗的正常血
免疫酶细胞化学实验技术2
（四）染色原理及步骤 1．基本原理 酶标抗体与荧光色素标记抗体的染色相同，亦分直接法和间接法。直接法是将酶直接标记在每一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。间接法所用的第一抗体是对组织细胞内某种抗原的特异性抗体（80%～90%的抗血清系由家兔制得，而绝大数单克隆
免疫分析法标记技术
基本原理：采用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原 -抗体反应，通过对免疫复合物中的标记物的测定，达到对免疫反应进行监测的目的。 标记免疫技术主要类型：放射免疫技术、酶免疫技术、荧光免疫技术、化学发光免疫技术 放射免疫标记技术（RIA） 基本原理:根据抗原抗体特异性结合
切口平移法标记探针的步骤
(1)模板 DNA 的制备用限制性内切酶将载体上的外源 DNA 酶切并进行琼脂糖凝胶电泳回收纯化,琼脂糖残留可抑制切口平移反应,因此彻底清除琼脂糖至关重要。也可以用带有外源 DNA 克隆片段的重组载体为模板来切口平移制备探针。(2)切口平移标记将模板 DNA 水溶液、DNase Ⅰ、未标记的三磷酸单
光谱法和非光谱法的异同
光谱法:当物质与辐射能作用时，物质内部发生能级之间的跃迁;记录由能级跃迁所产生的辐射能强度随波长(或相应单位)的变化，所得的图谱称为光谱。利用物质的光谱进行定性、定量和结构分析的方法称为光谱分析法，简称光谱法。非光谱法:非光谱法是基于物质与辐射相互作用时，测量辐射的某些性质，如折射、散射、干涉、衍射
免疫分析法的标记技术
基本原理：采用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原 -抗体反应，通过对免疫复合物中的标记物的测定，达到对免疫反应进行监测的目的。 标记免疫技术主要类型：放射免疫技术、酶免疫技术、荧光免疫技术、化学发光免疫技术 放射免疫标记技术(RIA) 基本原理:根据抗原抗体特异性结合
免疫分析法的标记技术
基本原理：采用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原 -抗体反应，通过对免疫复合物中的标记物的测定，达到对免疫反应进行监测的目的。标记免疫技术主要类型：放射免疫技术、酶免疫技术、荧光免疫技术、化学发光免疫技术 基本原理：利用化学或生物发光系统作为抗原抗体反应的指示系统，借以定量检测
非标记抗体免疫电镜实验——经典法
不标记抗体法通过系统的非标记抗体的免疫学反应，对组织中的抗原进行定位检测。分为用标记物显示和不同标记物显示两种方法。用于（1）抗体观察（2）免疫学研究。实验方法原理标记抗体法虽然具有许多优点，但也存在一些难以克服的问题，如标记抗体的分子增大，对细胞膜和组织的穿透力减弱；化学交联反应对抗体和酶的活性有
免疫分析法的标记技术
基本原理：采用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原 -抗体反应，通过对免疫复合物中的标记物的测定，达到对免疫反应进行监测的目的。标记免疫技术主要类型：放射免疫技术、酶免疫技术、荧光免疫技术、化学发光免疫技术 基本原理：利用化学或生物发光系统作为抗原抗体反应的指示系统，借以定量检测
标记抗原捕捉ELISA法的主要程序
① 用抗u链（抗IgM重链）抗体包被→37℃ 60分钟后置4℃过夜，洗涤三次、抛干② 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干③ 加酶标抗原 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干④ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。
免疫分析法的标记技术
基本原理：采用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原 -抗体反应，通过对免疫复合物中的标记物的测定，达到对免疫反应进行监测的目的。标记免疫技术主要类型：放射免疫技术、酶免疫技术、荧光免疫技术、化学发光免疫技术 基本原理：利用化学或生物发光系统作为抗原抗体反应的指示系统，借以定量检测