用寡聚（dT）作引物合成放射性标记的扣除cDNA探针
实验方法原理 本方案描述通过与 mRNA 驱动方杂交，继之以羟基磷灰石层析纯化单链放射性标记的 cDNA，制备扣除 cDNA 探针。实验材料 反转录酶反转录酶缓冲液驱动方 mRNA模板 mRNA试剂、试剂盒 乙酸铵DTTEDTA乙醇HCl异丁醇NaOH酚氯仿胎盘 RNA 酶抑制剂SDSSDS EDTA 溶液磷酸盐缓冲液SPS 缓冲液dNTP 溶液仪器、耗材 沸水浴冰水浴矿物油Sephadex G-50 柱微量离心管水浴或加热板实验步骤 一、材料1. 缓冲液与溶液乙酸铵（10 mol/L)DTT (1 mol/L)EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)乙醇HCl ( 2.5 mol/L)异丁醇NaOH ( 3 mol/L)酚：氯仿（1:1，V/V）胎盘 RNA 酶抑制剂（20 单位/μl）SDS ( 10% m/V)SDS/EDTA 溶液（30 mmol/L EDTA (pH 8.......阅读全文
用寡聚（dT）作引物合成放射性标记的扣除cDNA探针
实验方法原理 本方案描述通过与 mRNA 驱动方杂交，继之以羟基磷灰石层析纯化单链放射性标记的 cDNA，制备扣除 cDNA 探针。实验材料 反转录酶反转录酶缓冲液驱动方 mRNA模板 mRNA试剂、试剂盒 乙酸铵DTTEDTA乙醇HCl异丁醇NaOH酚氯仿胎盘 RNA 酶抑制剂SDSSDS EDT
用寡聚（dT）作引物合成放射性标记的扣除cDNA探针
本方案描述通过与 mRNA 驱动方杂交，继之以羟基磷灰石层析纯化单链放射性标记的 cDNA，制备扣除 cDNA 探针。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。实验方法原理本方案描述通过与 mRNA 驱动方杂交，继之以羟基磷灰石层析纯化单链放射性标记的 cDNA，制备扣除 cDNA 探针。实验
用寡聚（dT）作引物合成放射性标记的扣除
实验方法原理 本方案描述通过与 mRNA 驱动方杂交，继之以羟基磷灰石层析纯化单链放射性标记的 cDNA，制备扣除 cDNA 探针。 实验材料 反转录酶
用随机寡核苷酸延伸法进行扣除cDNA探针的放射性标记
实验方法原理 此方案中 cDNA 的合成是在 4 种饱和浓度的 dNTP 及一种痕量的放射性标记的 dNTP 中进行的。扣除杂交后，在大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ的 Klenow 片段作用下，富集的单链 cDNA 通过随机寡核苷酸引物延伸的二次合成反应，标记成高比活性的探针。由 于第一轮反应中
用随机寡核苷酸延伸法进行扣除cDNA探针的放射性标记
此方案中 cDNA 的合成是在 4 种饱和浓度的 dNTP 及一种痕量的放射性标记的 dNTP 中进行的。扣除杂交后，在大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ的 Klenow 片段作用下，富集的单链 cDNA 通过随机寡核苷酸引物延伸的二次合成反应，标记成高比活性的探针。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培
用随机寡核苷酸延伸法进行扣除cDNA探针的放射性标记
实验方法原理 此方案中 cDNA 的合成是在 4 种饱和浓度的 dNTP 及一种痕量的放射性标记的 dNTP 中进行的。扣除杂交后，在大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ的 Klenow 片段作用下，富集的单链 cDNA 通过随机寡核苷酸引物延伸的
用随机寡核苷酸引物从mRNA合成cDNA探针
实验方法原理 本方案以 poly(A) + RNA 作为模板，通过随机引物反应合成 cDNA 探针，这类探针可用于 cDNA 文库的差异筛选。实验材料 反转录酶反转录酶缓冲液随机脱氧核苷酸引物模板 mRNA试剂、试剂盒 乙酸铵DTTEDTA乙醇HClNaOH酚氯仿胰 RNA 酶抑制剂SDS Tris
用随机寡核苷酸引物从mRNA合成cDNA探针
本方案以 poly(A) + RNA 作为模板，通过随机引物反应合成 cDNA 探针，这类探针可用于 cDNA 文库的差异筛选。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。实验方法原理本方案以 poly(A) + RNA 作为模板，通过随机引物反应合成 cDNA 探针，这类探针可用于 cDNA
用随机寡核苷酸引物从mRNA合成cDNA探针
实验方法原理 本方案以 poly(A) + RNA 作为模板，通过随机引物反应合成 cDNA 探针，这类探针可用于 cDNA 文库的差异筛选。 实验材料
概述合成cDNA引物的选择
1、随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA
单链DNA探针技术简介
用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时,探针序列与被检测序列间有很多错配。而两条探针互补链之间的配对却十分稳定,即形成自身的无效杂交,结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA探针的合成方法主要有下列两种:(1) 以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片段合成单链探针; (2)
mRNA差别显示技术[DDRTPCR]
随着PCR技术的发展，人们在此基础上建立起了一系列基于基因分离的新技术新方法。如mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）、以及进一步改进的代表性差示分析（RAD），抑制性扣除杂交（SSH）和交互扣除RNA差别显示技术（RSDD）。差别显示ＰＣＲ是根据绝大多数真核细胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（
PAT法分析mRNA－Poly（A）尾长度实验
PAT法 [ PCR poly(A) test ] 可以快速、灵敏地从总 RNA 中分析特异 mRNA，而且可以定量估算 RNA poly(A) 尾长度。这方法中，包括 cDNA 合成的整个操作过程都在一个反应管中完成，不仅操作更简便，也减少了可能存在的 RNase 污染。本实验来源「RNA 实验指
PAT法分析mRNA－Poly（A）尾长度实验
实验方法原理 PAT法 [ PCR poly(A) test ] 可以快速、灵敏地从总 RNA 中分析特异 mRNA，而且可以定量估算 RNA poly(A) 尾长度。这方法中，包括 cDNA 合成的整个操作过程都在一个反应管中完成，不仅操作更简便，也减少了可能存在的 RNase 污染。尤其
PAT法分析mRNA－Poly（A）尾长度实验
实验方法原理 PAT法 [ PCR poly(A) test ] 可以快速、灵敏地从总 RNA 中分析特异 mRNA，而且可以定量估算 RNA poly(A) 尾长度。这方法中，包括 cDNA 合成的整个操作过程都在一个反应管中完成，不仅
cDNA－文库的构建（一）
实验材料 λ噬菌体臂大肠杆菌菌株用于λ噬菌体的包装抽提物试剂、试剂盒 放线菌素 D二硫苏糖醇EDTATris-ClMgCl2反转录酶RNase 抑制剂用于 cDNA 合成的寡核苷酸引物poly(A)+RNA[a-32P]dCTPEDTA乙醇(NH4)2SO4β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸T4
用DNA芯片技术检测基因的表达
一、芯片制备基因芯片的制备主要有两种基本方法，一是在片合成法，另一种方法是点样法。在片合成法是基于组合化学的合成原理,它通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序。在片合成法制备DNA芯片的关键是高空间分辨率的模板定位技术和固相合成化学技术的精巧结合。目前，已有多种模板技术用于基因
用DNA芯片技术检测基因的表达
一、芯片制备基因芯片的制备主要有两种基本方法，一是在片合成法，另一种方法是点样法。在片合成法是基于组合化学的合成原理,它通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序。在片合成法制备DNA芯片的关键是高空间分辨率的模板定位技术和固相合成化学技术的精巧结合。目前，已有多种模板技术用于基因
DNA探针的种类及其特点
核酸探针按性质划分可分为基因组 DNA 探针、cDNA 探针、RNA 探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。作为诊断试剂,较常使用的是基因组 DNA 探针和 cDNA 探针。其中,前者的应用最为广泛,它的制备可通过酶切或聚合酶链反应(PCR)从基因组中获得特异的 DNA 后将其克隆到质粒或噬菌体载体中
PCR技术（十七）：用PCR扩增cDNA库中的特异序列
最常用的基因分离方法需要建立组织或细胞RNA的cDNA库，然后用抗体或 DNA探针筛选出感兴趣的基因。虽然这个方法已成功地克隆了大量基因，但建立和筛 选CDNA库是一项非常耗时．费力的工作，而且用寡聚核苷酸作探针进行筛选需大量蛋 白质序列结构的资料。聚合酶链的反应（PCR）方法可使一种特异DNA扩增
PCR扩增CDNA库中的特异序列策略
最常用的基因分离方法需要建立组织或细胞RNA的cDNA库，然后用抗体或 DNA探针筛选出感兴趣的基因。虽然这个方法已成功地克隆了大量基因，但建立和筛 选CDNA库是一项非常耗时．费力的工作，而且用寡聚核苷酸作探针进行筛选需大量蛋 白质序列结构的资料。聚合酶链的反应（PCR）方法可使一种特异D
用PCR扩增cDNA库中的特异序列
最常用的基因分离方法需要建立组织或细胞RNA的cDNA库，然后用抗体或 DNA探针筛选出感兴趣的基因。虽然这个方法已成功地克隆了大量基因，但建立和筛 选CDNA库是一项非常耗时．费力的工作，而且用寡聚核苷酸作探针进行筛选需大量蛋 白质序列结构的资料。聚合酶链的反应（PCR）方法可使一种特
寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA
实验概要本实验介绍了寡聚(dT)-纤维素柱层析法纯化mRNA。此法利用mRNA 3’末端含有Poly(A )的特点，在RNA流经寡聚(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚(dT)纤维柱后，即
分子杂交技术的核酸探针标记法
核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。下面将介绍各种类型的探针及标记方法。 分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA
双链DNA探针随机引物合成法
随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是：(1)Klenow片段没有5'→3'外切
从RNA抽提到制成cDNA的全过程
一).构建cDNA文库：以生物细胞的总 mRNA 为模板，用反转录酶合成互补的双链 cDNA ，然后接到载体上，转入到宿主后建立的基因文库就是 cDNA 文库。1、mRNA的提取及其完整性的确定1） 总 RNA 的提取RNA 提取方法：APGC法或NP-40或应用试剂盒提取总RNA2）mRNA的分离
设计引物用cds序列和cdna序列的区别
cDNA和mRNA的序列是互补的，如果用两个引物，最后的两条DNA序列分别对应于mRNA和cDNA中的一段。由于引物方向从5‘至3’，所以两个引物对应于mRNA和cDNA中相应序列即可。
cDNA－3末端的快速扩增（3’RACE)
在用 oligo (dT) 引物构建的 cDNA 文库中，偶而发生部分 cDNA 克隆缺失了与靶 mRNA 3' 末端互补的序列。这部分序列到底是在 cDNA 合成过程中还是在分子克隆中怎样缺失和在哪个环节中缺失的尚不清楚。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。实验方法原理在用 o
cDNA－3末端的快速扩增（3’RACE)
实验方法原理 在用 oligo (dT) 引物构建的 cDNA 文库中，偶而发生部分 cDNA 克隆缺失了与靶 mRNA 3' 末端互补的序列。这部分序列到底是在 cDNA 合成过程中还是在分子克隆中怎样缺失和在哪个环节中缺失的尚
cDNA－3末端的快速扩增（3’RACE)
实验方法原理 在用 oligo (dT) 引物构建的 cDNA 文库中，偶而发生部分 cDNA 克隆缺失了与靶 mRNA 3' 末端互补的序列。这部分序列到底是在 cDNA 合成过程中还是在分子克隆中怎样缺失和在哪个环节中缺失的尚不清楚。第一链 cDNA 的随机断裂，在合成第二链 c