通过杂交筛选未扩增的黏粒文库（滤膜影印）
实验方法原理 经黏粒转化的稠密细菌菌落可通过杂交的方法筛选，该方法源于质粒转化菌落的大规模筛选（Hanahan and Meselon 1980)。实验步骤 一、材料1. 培养基含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 琼脂平板（150 mm )TB 培养基2. 专用设备厚玻璃板皮下注射针头（17号）灭菌的硝酸纤维素膜或尼龙膜（137 mm)灭菌的 Whatman 1 号滤纸3. 载体与菌株λ 噬菌体包装反应适合平板接种的大肠杆菌菌株（例如：XL1-BLUE, ED8767, NM554, DH5αMCR)。二、方法已包装到 λ 噬菌体颗粒中的黏粒 DNA 转化至大肠杆菌1. 计算能产生 3 万~ 5 万个转化菌落的包装反应体积。2. 准备数支灭菌的试管，试管中加有上述体积的包装反应产物和 0.2 ml 的接种细菌。3. 37℃ 温育试管 20 min。4. 在每支试管中加入 0.5 ml TB, 继续温育 45 mi......阅读全文
粘粒和质粒克隆的纯化实验
基本方案 实验材料 质粒 试剂、试剂盒
用杂交的方法筛选大片段插入的文库实验
实验步骤由于原代的转化子只能产生数目有限的滤膜，因而随机铺板不适合滤膜的制备以及 YAC、BAC 和 PAC 文库的保存，而且由于克隆增殖率存在差别，因而无论是哪一种扩增形式都会将偏差带人文库中去。因此，原代的转化子应加入微孔板中，放置于-8℃ 保存。这使得制造分配用的文库拷贝变得简单易行，而且使组
用杂交的方法筛选大片段插入的文库实验
由于原代的转化子只能产生数目有限的滤膜，因而随机铺板不适合滤膜的制备以及 YAC、BAC 和 PAC 文库的保存，而且由于克隆增殖率存在差别，因而无论是哪一种扩增形式都会将偏差带人文库中去。因此，原代的转化子应加入微孔板中，放置于-8℃ 保存。这使得制造分配用的文库拷贝变得简单易行，而且使组
利用血清筛选噬菌体文库PCR扩增的模板
[器材和试剂] ●MicroAmp反应管（PerkinElmer） ●洗脱缓冲液（20mmol/LTris—ClpH8．5，2mmol/LEDTA，1％TritonX—100） ●GeneAmp9600PCR仪（PerkinElmer） ●正向引物：5’—AGAGATTA
融合蛋白的免疫筛选实验——IPTG法
实验方法原理用抗体筛选λgt11 cDNA文库时，可待噬斑长到一定裎度方可诱导表达融合蛋白，筛选到阳性克隆的成功概率就可能大大增加。噬菌体生长3~4 h 后，将含诱导剂IPTG的滤膜放入噬斑平板，即可诱导β-半乳糖苷酶-cDNA融合蛋白的表达，继续在37℃培养，然后按基本方案用抗体对影印滤膜进行筛选
CDNA文库筛选
CDNA文库筛选（一）λgt11 cDNA文库铺平板宿主细菌制备1．用一个E.coli宿主菌株单菌落分别接种2×5ml LB培养基（Y1088用于噬菌斑杂交，Y1090用于免疫筛选），于37℃振荡培养过夜。2．将过夜培养物以3000×g离心5min。3．分别用2ml λ-dil（10 mmol/L
CDNA文库筛选
（一）λgt11 cDNA文库铺平板宿主细菌制备1．用一个E.coli宿主菌株单菌落分别接种2×5ml LB培养基（Y1088用于噬菌斑杂交，Y1090用于免疫筛选），于37℃振荡培养过夜。2．将过夜培养物以3000×g离心5min。3．分别用2ml λ-dil（10 mmol/L tris-Cl,
黏粒的特性特点
黏粒有4个特点：①具有λ噬菌体的特性。黏粒在克隆了外源DNA在体外包装成噬菌体颗粒后，可以感染宿主菌并在细菌内按照λ噬菌体DNA的方式环化起来。但黏粒载体不含有λ噬菌体的全部必要基因，因此不会使宿主菌裂解，无法形成子代噬菌体颗粒。②具有质粒的特性。黏粒具有质粒复制子，可在宿主菌内像质粒DNA一样进行
噬菌体文库的铺平板和转移实验
基本方案 实验材料 噬菌体 试剂、试剂盒
噬菌体文库的铺平板和转移实验
实验材料 噬菌体试剂、试剂盒 琼脂糖LBNaOHSSCTris·Cl仪器、耗材 硝酸纤维素膜培养箱实验步骤 1. 通过系列等比稀释滴定噬菌体文库的滴度。 2. 重组噬菌体与铺平板的宿主菌混合于培养试管中（表一），于37 ℃温育20 min。 表一、噬菌体文库铺平板组分最佳配制方法 3. 按每个
Dharmacon文库在RNAi文库筛选的应用
1.什么是文库？――大幅提高研究效率的利器以往的实验室研究中，无论是寻找新基因的功能、探索已知基因致病的机制、解析复杂信号通路网络、探索疾病发生发展的机制，药物敏感性测试或者是寻找药物开发的新靶点，科研工作者们往往是围绕着潜在的单个目标基因进行改造，包括针对该基因的过表达、沉默、敲除、激活、修饰、突
噬菌体DNA从噬菌斑到滤膜的转移实验
一个从 λ 噬菌体文库中鉴别和分离特异重组子的方法，在分子克隆历史的早期由 Bemon 和 Davis (1977) 建立起来。这个目前仍经常使用的方法，包括通过用 32P 标记的探针进行原位杂交以大量筛选噬菌斑。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。实验方法原理一个从 λ 噬菌体文库中鉴
粘粒及质粒文库的铺平板和转移实验——基本方案
文库一旦包装就应该尽快进行扩增，它可以大大增加文库的拷贝数，但在扩增时由于克隆的生长速率不同，文库的组成可能会出现某种潜在的改变。这种文库克隆组成比率的变化可以通过把文库克隆预吸附到细菌上并使用一种高密度铺平板和短期培养的方法而尽量减少。实验材料质粒试剂、试剂盒LBNaOH氯霉素Tris·ClNaC
YAC实验——YAC文库筛选
实验步骤1. YAC中心实验室用于筛选文库的方法进展很快。2. 将一块或多块微量滴定板微孔中的YAC克隆转印到尼龙膜上，用单拷贝探针进行杂交，就可以筛选YAC文库了。3. 然而，由 于杂交实验的信噪比较低以及制备所有的转印尼龙膜所需的花费巨大，绝大多数实验室已采用PCR方法来筛选文库。4.
DNA文库的构建及其筛选
DNA文库的构建和筛选可以用于：（1）将某生物的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度的DNA片段，再与适合的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。 （2）采用“化整为零”策略，将庞大的基因分解成一段段，每段包含一个或几个基因。实验方法原理高等植物基因组的一个显著特征
DNA文库的构建及其筛选
实验材料 DNA试剂、试剂盒 升汞MS培养基琼脂糖EcoR IHind IIIBamH IBg lII Pst I仪器、耗材 电泳仪尼龙膜实验步骤 1.水稻 DNA 的提取水稻 DNA 的提取参照 Dellaporta, Wood 和 Hicks (1983) 法分离总基因组DNA并略有修改。 通过
DNA文库的构建及其筛选
实验方法原理 高等植物基因组的一个显著特征是其内含有大量的 DNA 重复序列, 重复序列常位于异染色质区, 因此可能与染色体的结构有关 . 季静等根据国际上 对基因组、染色体、结构蛋白的研究前沿, 提出染色体 DNA 平均每隔 30 kb
cDNA文库的构建和筛选
材料许多生物是疾病研究或探索使细胞和机体应对和存活于不同刺激下的分子适应机制的优良模型。 cDNA 文库的构建和随后目的基因的筛选可促使研究者发现在调节和响应某些外部特定环境压力中有重要作用，而在其他体系中可能不表达或者不存在的新基因。确定这些新基因的可读框，进一步分析其编码蛋白质的功能可以开创全新
噬菌体DNA从噬菌斑到滤膜的转移实验
实验方法原理 一个从 λ 噬菌体文库中鉴别和分离特异重组子的方法，在分子克隆历史的早期由 Bemon 和 Davis (1977) 建立起来。这个目前仍经常使用的方法，包括通过用 32P 标记的探针进行原位杂交以大量筛选噬菌斑。实验材料 λ 噬菌体文库大肠杆菌铺平板细菌试剂、试剂盒 变性液中和液SM
噬菌体DNA从噬菌斑到滤膜的转移实验
实验方法原理 一个从 λ 噬菌体文库中鉴别和分离特异重组子的方法，在分子克隆历史的早期由 Bemon 和 Davis (1977) 建立起来。这个目前仍经常使用的方法，包括通过用 32P 标记的探针进行原位杂交以大量筛选噬菌斑。
噬菌体文库的扩增实验
文库一旦包装就应该尽快进行扩增，它可以大大增加文库的拷贝数，但在扩增时由于克隆的生长速率不同，文库的组成可能会出现某种潜在的改变。这种文库克隆组成比率的变化可以通过把文库克隆预吸附到细菌上并使用一种高密度铺平板和短期培养的方法而尽量减少。文库一旦包装就应该尽快进行扩增，它可以大大增加文库的拷贝数，但
噬菌体文库的扩增实验
基本方案 实验材料 噬菌体 试剂、试剂盒
噬菌体文库的扩增实验
实验材料 噬菌体试剂、试剂盒 MgSO4麦芽糖琼脂糖氯仿DMSOSM仪器、耗材 离心机分光光度计水浴锅实验步骤 1. 制备铺平板菌（1）2.5 ml 新鲜过夜培养的宿主菌液接种于250 ml 含0.2%麦芽糖和10 mmol/l MgSO4的LB培养液中。（2）在37℃恒温摇床剧烈摇荡2~4 h，
简述黏粒的主要特征
(1)由质粒与λDNA组成的一种4～6kb的环状杂种DNA，容易分离并可离体操作。携带抗生素抗性基因为选择标记，带有pUC质粒的细菌能在含抗生素的培养基上生长。它既能像质粒一样在细菌中繁殖(pJB8、c2RB等)，有的可以在哺乳动物细胞内繁殖(pWEl5/16等)，又能像λDNA一样体外包装，并
黏粒的定义组成和功能
黏粒英文cosmid，指带有黏端位点(cos)的质粒。黏粒是由人工构建的含有λ噬菌体DNA的cos序列和质粒复制子的载体。黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、氨苄青霉素抗性标记、cos位点。
基因组文库和cDNA文库的构建及筛选
刘芝华 中国医学科学院肿瘤研究所 分子肿瘤学国家重点实验室 概念： 基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体；cDNA文库是指含有所有重组cDNA的克隆群体。 基因组文库：来源于基因组DNA，反映基因组的全部信息，用于基因组物理图谱的构建，基因组序列分析，基因在染色体上
常用的分子生物学基本技术1
DNA重组技术（或基因工程）是20世纪生物学的伟大成就，并已渗透到生命科学包括医学 各个领域，为肿瘤的实验研究和临床诊断及治疗提供了崭新的技术和有用的工具。本附录扼要介绍在分子肿瘤学领域中常用的分子生物学基本技术及其在肿瘤研究中的应用，着重介绍它们的原理和应用。至于具体的技术方法和操作步骤可参阅《分
滤膜杂交的方法介绍
中文名称滤膜杂交英文名称filter hybridization定 义将样品转移或直接点在滤膜(如硝酸纤维素膜、尼龙膜等)上，以滤膜为支持物进行杂交的方法。洗膜后只有与目的物杂交的分子留在膜上。应用学科生物化学与分子生物学（一级学科），方法与技术（二级学科）
随机RNA文库的SELEX筛选实验
实验方法原理 SELEX 技术是一种利用随机寡核苷酸（DNA 或 RNA）文库筛选靶分子的特异性配基的组合化学技术。最常用的是随机 RNA 文库，因为 RNA 分子中除 G-C、A-U 碱基对以外，还有 G-U 等变偶碱基对的存在，可以形成发夹、假结、凸环、G-四聚体等多种空间结 构，它
随机RNA文库的SELEX筛选实验
随机RNA文库的SELEX筛选实验可用于：（1）体外诊断；（2）体内治疗等。实验方法原理SELEX 技术是一种利用随机寡核苷酸（DNA 或 RNA）文库筛选靶分子的特异性配基的组合化学技术。最常用的是随机 RNA 文库，因为 RNA 分子中除 G-C、A-U 碱基对以外，还有 G-U 等变偶碱基对的