痘苗DNA检测实验
实验方法原理 实验材料 贴壁生长良好的单层 BS-C-1 或 HuTK-143B 细胞重组病毒噬斑悬液试剂、试剂盒 PBS胰酶／EDTA干冰／乙醇DNA 提取缓冲液乙酸钠乙醇PCR 扩增缓冲液引物完全 MEM-10、MEM-2.5 和 MEM-5 培养基完全 MEM-10／BrdU 培养基筛选试剂4 dNTP 混合物MgCl2仪器、耗材 24 孔组织培养板杯状超声仪实验步骤 实验试剂准备详见「其他」。1. 吸出汇片生长单层细胞的培养基。1.1 对于 XGPRT 筛选，用 BS-C-1 细胞。1.2 对于 TK 筛选，用 HuTK-143B 细胞。2. 用 37℃ 的 PBS 或胰酶/EDTA 洗细胞 1 次，以除去剩余血清。3. 用刚好覆盖单层细胞、37℃ 的胰酶/EDTA（对于 150 cm2 培养瓶需要 1.5 ml）覆盖细胞。消化 30 s （细胞应该分开），晃动培养瓶使细胞完全分开。4. 加入 8.5 ml 适当培养基。......阅读全文
痘苗DNA检测实验
实验方法原理 实验材料 贴壁生长良好的单层 BS-C-1 或 HuTK-143B 细胞重组病毒噬斑悬液试剂、试剂盒 PBS胰酶／EDTA干冰／乙醇DNA 提取缓冲液乙酸钠乙醇PCR 扩增缓冲液引物完全 MEM-10、MEM-2.5 和 MEM-5 培养基完全 MEM-10／BrdU 培养基筛选试剂4
痘苗DNA检测实验
PCR 法 斑点杂交法 Southern 杂交法 实验方法原理 实验材料
痘苗病毒DNA提取实验
基本方案 实验方法原理 实验材料 纯化的痘苗病毒
痘苗病毒DNA提取实验
如果提取的痘苗病毒DNA用于转染，则应在蛋白酶 K 消化和苯酚抽提后分离。具体方法见本实验。实验材料纯化的痘苗病毒试剂、试剂盒Tris•Cl 溶液SDS蔗糖溶液蛋白酶 K用 50 mmol／L Tris • Cl 溶液平衡的苯酚1：1苯酚氯仿1 mol／L 乙酸钠乙醇仪器、耗材分光光度计Sorval
痘苗病毒DNA提取实验
实验方法原理 实验材料 纯化的痘苗病毒试剂、试剂盒 Tris•Cl 溶液SDS蔗糖溶液 蛋白酶 K用 50 mmol／L Tris • Cl 溶液平衡的苯酚1：1苯酚氯仿1 mol／L 乙酸钠乙醇仪器、耗材 分光光度计Sorvall 离心机实验步骤 1. 在 260 nm 处确定纯化的疸苗病毒的光密
痘苗DNA检测实验——PCR－法
除了 PCR 和 Southern 杂交可以检测病毒 DNA 外，也可以利用 DNA 点迹杂交方法检测在分离的噬斑中的重组病毒。本实验主要介绍用这3种方法来检测痘苗DNA。实验材料贴壁生长良好的单层 BS-C-1 或 HuTK-143B 细胞重组病毒噬斑悬液试剂、试剂盒PBS胰酶／EDTA干冰／乙醇
痘苗DNA检测实验——Southern－杂交法
实验方法原理以前，用 HindIII 限制性内切核酸酶消化鉴定痕苗病毒 DNA。大部分的外源基因插入重组病毒的 TK 基因中，TK 基因位于 HindIII 5.1 kb 的 J 片段上。这样在重组病毒中，如果插入片段上没有 HindIII 内切酶位点，则J片段就会增大。如果缺乏 HindIII 5
痘苗DNA检测实验——斑点杂交法
实验材料贴壁生长良好的单层 BS-C-1 或 HuTK-143B 细胞重组病毒噬斑悬液试剂、试剂盒NaOHTris • Cl2×SSCPBS胰酶／EDTA干冰／乙醇DNA 提取缓冲液乙酸钠乙醇PCR 扩增缓冲液引物完全 MEM-10、MEM-2.5 和 MEM-5 培养基完全 MEM-10／BrdU
痘苗病毒纯化实验
实验方法原理 对于很多研究，部分纯化的病毒就足够了（进行到本实验步骤 14）， 如果是纯化 MVA 病毒，则不能用胰酶消化，也不能用 CEF 细胞或 BHK-21 细胞代替 HeLa 细胞。实验材料 痘苗病毒储液HeLa S3 细胞（悬浮培养）试剂、试剂盒 胰酶Tris • Cl蔗糖仪器、耗材 旋转
痘苗病毒纯化实验
痘苗病毒通常采用蔗糖密度梯度离心的方法纯化。纯化的病毒可用于制备痘苗病毒 DNA ，用于不允许存在感染细胞蛋白污染的研究中，同时也可以用作高滴度的病毒储液。对于大规模的纯化（至少 1 L 的培养物），最好的方法是用 HeLa 细胞悬液作为感染的对象，而不要用单层培养的细胞。内容来源于《精编分子生物学
痘苗病毒纯化实验
大规模纯化 实验方法原理 对于很多研究，部分纯化的病毒就足够了（进行到本实验步骤 14）， 如果是纯化 MVA 病毒，则不能用胰酶消化，也不能用 CEF 细胞
痘苗病毒储液制备
基本方案 噬斑分析测定滴度 实验方法原理 实验材料 悬浮培养的 HeLa S3
痘苗病毒储液制备
实验材料悬浮培养的 HeLa S3 细胞痘苗病毒试剂、试剂盒完全 MEM-10 和 MEM-2.50.25 mg ml 胰酶仪器、耗材Sorvall H-6000A 转子150 cm2 组织培养瓶CO2 培养箱实验步骤1. 用血细胞计数器对悬浮培养的 HeLa S3 细胞进行细胞计数。2. 将 5×
痘苗载体转染细胞实验
实验方法原理 将感兴趣的外源基因亚克隆到质粒转移载体上，外源基因的两端为痘苗病毒基因组非必需基因片段。随后，将重组质粒转染病毒感染的细胞，痘苗病毒基因组与质粒上同源的部分发生同源重组。应用适当的筛选方案，经几轮噬斑纯化，从细胞裂解物中获得重组病毒。实验材料 pSCll／pRB21／pSC65／pLW
痘苗病毒储液制备
实验方法原理 实验材料 悬浮培养的 HeLa S3 细胞痘苗病毒试剂、试剂盒 完全 MEM-10 和 MEM-2.50.25 mg ml 胰酶仪器、耗材 Sorvall H-6000A 转子150 cm2 组织培养瓶CO2 培养箱实验步骤 1. 用血细胞计数器对悬浮培养的 HeLa S3 细胞进行细
痘苗载体转染细胞实验
CaCl2 法 DOTAP 法 实验方法原理 将感兴趣的外源基因亚克隆到质粒转移载体上，外源基因的两端为痘苗病毒基因组非必需基因片段。随后，将重组质
痘苗病毒系统基因表达实验
重组痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂质体转染 两种重组痘苗病毒共感染细胞 实验方法原理 本方案从构建外源基因位于 PT7 和 T7 终止子之间的质
痘苗病毒系统基因表达实验
实验方法原理 本方案从构建外源基因位于 PT7 和 T7 终止子之间的质粒载体开始，然后用重组质粒通过脂质体介导转染已经被vTF7-3（可以持续表达T7 RNA聚合酶的痘苗病毒）感染的细胞。收获后，基因产物在细胞内的表达可以用脉冲标记的方法或用「重组痘苗病毒及其产物的鉴定实验」中叙述的方法分
痘苗载体转染细胞实验——DOTAP－法
实验方法原理将感兴趣的外源基因亚克隆到质粒转移载体上，外源基因的两端为痘苗病毒基因组非必需基因片段。随后，将重组质粒转染病毒感染的细胞，痘苗病毒基因组与质粒上同源的部分发生同源重组。应用适当的筛选方案，经几轮噬斑纯化，从细胞裂解物中获得重组病毒。实验材料pSCll／pRB21／pSC65／pLW9
痘苗病毒系统基因表达实验（二）
实验方法原理含有 pT7 控制的外源基因（本实验「重组痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂质体转染」）的重组质粒，通过同源重组可整合到痘苗病毒中,并制备重组病毒储液。将此病毒储液与 vTF7-3 共同感染贴壁或悬浮细胞，在培养过程中，外源基因被高效的 T7 RNA 聚合酶转录，并在感染细胞的细胞质完成
痘苗病毒系统基因表达实验（一）
本节介绍依赖于在哺乳动物细胞质合成噬菌体 T7 RNA 聚合酶的瞬时细胞质表达系统。首先，将感兴趣的基因插入质粒中，使其位于 T7 RNA 聚合酶启动子（PT7）的控制下。应用脂质体转染，重组质粒进入感染了 vTF7-3 的细胞质中，而 vTF7-3 是一种能编码噬菌体T7 RNA聚合酶的重组痘苗病
痘苗载体转染细胞实验——CaCl2－法
实验方法原理将感兴趣的外源基因亚克隆到质粒转移载体上，外源基因的两端为痘苗病毒基因组非必需基因片段。随后，将重组质粒转染病毒感染的细胞，痘苗病毒基因组与质粒上同源的部分发生同源重组。应用适当的筛选方案，经几轮噬斑纯化，从细胞裂解物中获得重组病毒。实验材料pSCll／pRB21／pSC65／pLW9
痘苗病毒储液制备——噬斑分析测定滴度
实验方法原理经胰酶作用的系列稀释病毒储液常被用于感染适当的细胞系。经过几天的培养后，吸出培养基，将细胞用结晶紫染色。由于感染细胞变缩、变圆和脱落，形成直径 1～2 mm 颜色较淡的噬斑。实验材料生长良好的贴壁培养的单层 BSC-1 细胞病毒储液试剂、试剂盒0.1% 结晶紫（溶于 20% 乙醇）仪器、
我国艾滋病疫苗开始I期临床试验
据科技日报北京12月1日电 在第20个世界艾滋病日到来之际，我国艾滋病研究又传来振奋消息：DNA—天坛痘苗复合型艾滋病疫苗于今天在北京协和医院开始第一组志愿者的疫苗接种，这标志着我国用一种全新方法研制的艾滋病疫苗进入Ⅰ期临床试验。该艾滋病疫苗是在国家863计划课题及欧盟第五框架INCO项目的资助下，
中国艾滋病疫苗进入临床试验阶段已有31人接种
发现艾滋病31年后，首个用于未受感染人群预防的药物在今年7月16日被美国FDA批准上市。10天后结束的第19届世界艾滋病大会上，首位被治愈者现身，人们看到了控制艾滋病疫情的曙光。 记者昨天从北京佑安医院获悉，我国科技重大专项艾滋病疫苗Ⅱ期临床试验已于上周在该院启动，首批31名
表达蛋白检测实验_点印迹法
实验方法原理本方案用DNA点迹杂交检测噬斑以鉴定重组病毒。像点迹杂交一样，将感染细胞裂解物印迹在硝酸纤维素膜上（可参考「痘苗DNA检测实验」中「斑点杂交法」）。用可以识别外源基因表达蛋白的抗体与膜一起孵育，用125I 标记的蛋白 A 检测结合的抗体，还可应用化学发光检测系统，如 Amersham E
关于腺相关病毒载体的基本介绍
腺病毒相关病毒(adeno-associated virus，AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染
腺相关病毒载体的简介
腺病毒相关病毒(adeno-associated virus，AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染
以毒攻毒杀死肿瘤，这项作价千万元成果获批临床
“我们的成果一旦迈入产业化，肿瘤患者只需打一针就有望治愈，费用将是现在的几十分之一。”浙江理工大学生命科学与医药学院教授李恭楚的这个愿望即将实现。日前，他团队研发的肿瘤药物“GC001溶瘤痘苗病毒注射液”正式获得国家药品监督管理局临床试验批件。“溶瘤痘苗病毒改造技术是浙江理工大学首个技术作价成果，也
经典免疫学时期概述
这一时期起始于18世纪末至20世纪中。其特点是人们对免疫功能的认识从人体现象的观察进入了科学实验时期。它的发展是与微生物学的发展密切相关的，并成为微生物学的一个分支。这一时期内的重要成就如下述。 1．牛痘苗的发明 继人痘苗之后，免疫学的一个重要发展首推牛痘苗的发明。它不但弥补了人痘苗的不足，并