分子生物学实验诊断技术（二）
（三）Northern blot用于RNA分析，电泳条件与转膜方法与Southern blot不同外，RNA不必变性与中和，电泳时加电醛防止RNA发夹结构形成。其它步骤相同。为了防止RNase水解需分析的mRNA，尽可能将器皿在160-180℃干热灭菌8小时以上，也可加0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）泡2小时，灭菌水淋洗干净，100℃干烤15分钟。不能干热灭菌的试剂等，也可加1％DEPC处理12小时（但不能用于Tris）后，100℃。加热15分钟（或高压灭菌15分钟）以抑制、分解RNase。1.0g琼脂糖，灭菌水80ml加热溶解。加x50TAE2ml，EB25μl，灭菌水至1000ml。样品缓冲液，x50TAE20μl，50％去离子甲酰胺500μl，甲醛180μl，混匀。约10-30μg/10μl纯化的RNA样品，加二倍（20μl）样品缓冲液（可点样一个凝胶孔lane）。60℃水浴15min，马上置冰浴。加1/10电泳指示剂。点......阅读全文
分子生物学实验诊断技术（二）
（三）Northern blot用于RNA分析，电泳条件与转膜方法与Southern blot不同外，RNA不必变性与中和，电泳时加电醛防止RNA发夹结构形成。其它步骤相同。为了防止RNase水解需分析的mRNA，尽可能将器皿在160-180℃干热灭菌8小时以上，也可加0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC
分子生物学实验诊断技术
一、酸杂交技术检验方法建立的基本要素是特异性和灵敏度，在复杂的物体中，使无法感觉的特定物质进入人类的观察范围。核酸杂交检测技术就是利用核酸碱基严格配对的特异性，核酸标记物的灵敏度而建立的检测核酸结构与功能的方法。该法建立以来已有二十年，目前研究实验室用得多，临床实验室用得较少，除成本高外，关键是操作
分子生物学实验诊断技术
一、酸杂交技术检验方法建立的基本要素是特异性和灵敏度，在复杂的物体中，使无法感觉的特定物质进入人类的观察范围。核酸杂交检测技术就是利用核酸碱基严格配对的特异性，核酸标记物的灵敏度而建立的检测核酸结构与功能的方法。该法建立以来已有二十年，目前研究实验室用得多，临床实验室用得较少，除成本高外，关键是操作
分子生物学实验诊断技术（一）
一、核酸杂交技术 检验方法建立的基本要素是特异性和灵敏度，在复杂的物体中，使无法感觉的特定物质进入人类的观察范围。核酸杂交检测技术就是利用核酸碱基严格配对的特异性，核酸标记物的灵敏度而建立的检测核酸结构与功能的方法。该法建立以来已有二十年，目前研究实验室用得多，临床实验室用得较少，除成
分子生物学实验小技术（二）
1 、 各供应商送货时往往会提供冰袋，在室温下将化冻的大冰袋平整的一面整齐地插入1.5ml 或0.5ml 、0.2ml 的废弃离心管；或将几个化冻后的小冰袋填料塞入一个小泡沫盒中压实，再插入各种大小的试管，放在-20 摄氏度下冻24小时后取出，拔出插入的废管（可加点热水以助拔管）即可做成一个
分子生物学常用实验技术（二）
第三节操作步骤 一、细菌的培养和收集 将含有质粒pBS 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。 二、质粒D
口蹄疫分子生物学诊断技术
近年来，由于分子生物学技术的迅速发展及其在FMD诊断中的应用，建立了各种FMD的分子生物学诊断技术，主要包括以下几种方法，核酸杂交、等电点聚焦电泳、寡核苷酸指纹图谱分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚合酶链式反应、单克隆抗体技术等。（1）核酸探针 核酸探针即应用FMD的cDNA克隆片段，用32P或生物素等标
基因诊断的分子生物学基础（二）
三、RNA分子结构 （一）RNA类型 细胞内含有三类主要的RNA，即核蛋白体RNA（Ribosomal RNA， rRNA）、转运RNA（Transfer RNA，tRNA）及信使（Messenger RNA，mRNA）。 1．rRNA。是核蛋白体的组成部分，含量最多，约占细胞内全部RNA
猪丹毒分子生物学诊断技术
常规细菌培养检测猪丹毒至少要3天，鉴定血清型大约要lo天，而这种PCR法可在5h内完成。它使用两步扩增法，先用高度特异性引物组M0101-M0102进行初步扩增之后，再添加4种特异性寡核苷酸引物组对4种不同血清型猪丹毒的16SrRNA序列进行扩增。 rRNA基因簇包括16SrRNA、23
分子生物学实验小技术
当找到可能的重组质粒且条带清晰时可直接切下含DNA 的凝胶条带，用胶回收DNA 的方法回收质粒并进行酶切鉴定，如果DNA 量太少则需重提质粒。 用QIAprep Miniprep Spin 小量提质粒注意以下事项可提高得率A．用含抗生素的培养基培养细菌会有较高的得率。B．收菌时用tips吸干净残余的
常用的分子生物学基本技术（二）
载体 所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。细菌质粒 是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。最常用的质粒是pBR322。噬菌体（phaeg） 噬菌体是感
常用的分子生物学基本技术（二）
PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二
31项与免疫学有关的分子生物学实验技术（二）
十二、大肠杆菌感受态细胞（E.coli DH5α）制备E.coli DH5α制备主要操作步骤：1）挑取受体菌（DH5或DH10B）的单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2）取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-30
常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍（二）
核酸原位杂交用特定标记的已知顺序核酸作为探针与细胞级或组织切片中核酸进行复性杂交并对其实行检测的方法，称为核酸原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）。用来检测DNA在细胞核或染色休上的分布，与细胞内RNA进行杂交以研究该组织细胞中特定基因表达水闰；还
分子生物学常用实验技术（十）
第二节RFLP 技术一、材料 基因组DNA(大于50kb,分别来自不同的材料)。二、设备 电泳仪及电泳槽， 照相用塑料盆5 只，玻璃或塑料板(比胶块略大) 4 块，吸水纸若干，尼龙膜(依胶大小而定)，滤纸，eppendorf 管(0.5ml)若干。三、试剂：1、限制性内切酶(BamHⅠ, Ec
分子生物学常用实验技术（五）
第四章RNA 的提取和cDNA 合成 第一节概述 从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA 的第一链和第二链,将双链cDNA 和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA 文库,构建的cDNA 文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA 和相
分子生物学常用实验技术（十三）
2. 从RNA 合成单链cDNA 探针cDNA 单链探针主要用来分离cDNA 文库中相应的基因。用RNA为模板合成cDNA 探针所用的引物有两种: (1)用寡聚dT 为引物合成cDNA 探针。本方法只能用于带Poly(A)的mRNA,并且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3'末端序列
分子生物学常用实验技术（十八）
五、操作步骤：（一）、模板制备1、M13 单链模板制备：在转化入合适的大肠杆菌宿主菌且在含有指示剂如X-gal/IPTG 的培养基上铺板之后, 含有M13 重组子的细胞将表现出无色的"噬菌斑"，事实上受感染的细胞并非被噬菌体溶菌或杀死，出现噬菌斑是因为被感染的细菌在生长速度上比其周围未感染的
分子生物学常用实验技术（十七）
第二节T7 DN A 聚合酶测序技术一、概述 T7 DNA 聚合酶最初具有5'→3'聚合酶活性以及单链和双链3'→5'外切酶活性。当T7 DNA 聚合酶用适当方法处理后，可使3'→5'外切酶活力明显下降。改造后的T7 DNA 聚合酶又称T7
分子生物学常用实验技术（十一）
第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆第一节概述 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA 或RNA 的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94℃下解链; (2) 退火
分子生物学常用实验技术（七）
（四） 电泳分析 通常合成的cDNA 第一链和第二链长度为350-6000 碱基,需进行1.4%碱性琼脂糖电泳。将第一链和第二链掺入测定管中的反应液先用酚抽提,乙醇沉淀，方法见本章（二）第二链合成中的9-12 步，一般第一链和第二链上样量相同。1. 标准分子量DNA 参照物的同位素标记(1) 通常
分子生物学常用实验技术（九）
第三节从动物组织提取基因组DNA一、材料 哺乳动物新鲜组织。二、设备 移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。三、试剂1、分离缓冲液：10mmol/L Tris?Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶K (20mg/
分子生物学常用实验技术（十五）
第十章测序技术 在分子生物学研究中，DNA 的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger 等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam 和Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随
分子生物学常用实验技术（十六）
（三）电泳：1、预电泳（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。（2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE 缓冲液。（3）稀释10×TBE 缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳
分子生物学常用实验技术（六）
一、材料 提纯TMV 病毒液（10mg/ml）。二、设备 冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳仪，电泳槽。三、试剂 TE-饱和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE 缓冲液，无RNA 酶的双菌水。四、操作步骤1、取一eppendorf 管加入提纯
分子生物学常用实验技术（八）
第五章重组质粒的连接、转化及筛选第一节概述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA 片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA 和目的DNA 片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得
分子生物学常用实验技术（一）
第一章质粒DNA 的分离、纯化和鉴定第二章DNA 酶切及凝胶电泳第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第四章RNA 的提取和cDNA 合成第五章重组质粒的连接、转化及筛选第六章基因组DNA 的提取第七章RFLP 和RAPD 技术第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆第九章分子杂交技术第十章测
分子生物学常用实验技术（十四）
三、菌落原位杂交 对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。1、材料：待检测的细菌平皿，已标记好的探针
分子生物学常用实验技术（四）
第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第一节概述 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外
分子生物学常用实验技术（三）
第二章DNA 酶切及凝胶电泳第一节概述一. DNA 的限制性内切酶酶切分析 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP 的存在。Ⅰ类酶结