清华大学Nature子刊：将Cas9应用于分子克隆
在4月21日的《自然实验手册》（Nature Protocols）杂志上，清华大学的朱听（Ting Zhu）研究员与博士生姜文君（Wenjun Jiang）撰文，详细介绍了利用一种叫做Cas9辅助靶向染色体片段（CATCH）的方法，靶向分离及克隆100kb微生物基因组序列的优化实验方案。 朱听研究员的主要研究方向包括合成生物学、人造细胞；新一代高通量DNA测序、宏基因组学；高通量DNA测序在癌症和传染病等疾病领域中的应用；生命的起源、远古生命与极端条件下生命体的发现与测序。 随着各种微生物基因组测序工作的不断完成和序列信息的大量累积，微生物基因组研究的重点已从结构基因组学转为功能基因组学，大量未知功能的基因和基因簇有待大家去解析。在细菌的基因组中，功能密切相关的基因常聚集在一起，形成一个大的基因簇或操控子。很多细菌的基因组中存在基因组岛，与细菌的毒力、耐药等密切相关，它们常作为一个整体在细菌之间进行转移。要分析基因簇或基......阅读全文
分子克隆蛋白表达实验指南（七）
目的基因表达 14．快速诱导表达 快速诱导目的是为检测该重组质粒在BL21中是否能被诱导表达重组蛋白，并确定在不同IPTG浓度蛋白诱导效率的差异。 5． 挑单克隆菌落于7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml培养管中，37C振荡培养过夜（8-16h）。 6． 37C，1mM
分子克隆蛋白表达实验指南（十九）
Desired pH Volume of 1M K2HPO4 (mL)Volume of 1M KH2PO4 (mL) 5.8 8.591.5 6.0 13.286.8 6.2 19.280.8
分子克隆蛋白表达实验指南（一）
目的基因克隆包括保存用全长基因(gene for saving, GS)和表达用全长基因(gene for expression, GE)两部分。 这两部分所克隆的基因都是全长片段，但克隆的策略及目的不同。直接用精确克隆(及引物从基因CDS两端开始)很难找到高效价的引物，且cDNA中目的基
分子克隆蛋白表达实验指南（九）
SDS-PAGE胶样品排列： MUIBS1S1P1BS2S2P2UIT1T2T3T4 M：marker；上样10ul UI：未诱导对照；10ul BS：超声前样品；10ul S：超声后上清； 10ul P：超声后沉淀； 10ul T：诱导后每隔1h样品，1
分子克隆蛋白表达实验指南（十七）
Buffers for His purification in denatured conditions: 配制时加终体积50％的水，之后定容至所需体积。先配pH 8.0的buffer(调pH需要较多NaOH)，再统一配bufferC，D，E，分别调pH Buffer B (200ml
分子克隆蛋白表达实验指南（四）
7. PCR产物与TA载体连接 pGEM-T vector is T-tailed at the insert site. To improve the ligation efficiency, it is recommended PCR product be A-tailed. +A s
分子克隆蛋白表达实验指南（六）
10. 测序 突变后氨基酸序列没有变化仍可用于表达。测序报告中blast时若有‘－’符号，则人工对照测序图谱。 测序验证后没有突变或者同义突变的重组质粒必须小抽，50ul，conc300ug/ml备份。测序文件应妥善保存，蛋白表达完成后一并提交存档。 获得GS后，即可构建含GE的重组T载体，用
分子克隆蛋白表达实验指南（八）
15. 小量蛋白诱导表达 该步骤的目的是检测蛋白是否在上清存在表达。低温时蛋白易于表达于上清，因此小量蛋白诱导表达以20或30C为培养温度。 1. 挑一单克隆的菌落于5ml含有相应的抗生素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜（8-16h）。 2. 过夜培养液加入三瓶50ml含
分子克隆化载体DNA的选择介绍
①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松弛型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以
简述分子克隆化的重要意义
在医学方面，利用分子克隆技术已将胰岛素，人、牛和鸡的生长激素、人的干扰素、松弛素、促红细胞生长激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用发酵工业进行了大规模生产。还可提高微生物本身所产生的蛋白酶类和抗生素类药物的产量。 在基因治疗方面。通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞
分子克隆化DNA片段的制备介绍
常用以下方法获得DNA片段： ①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段； ②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段； ③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段； ④从mRNA反转录产生cDNA。
分子克隆实验引入寄主细胞的常用方法
常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比
关于分子克隆化引入寄主细胞的介绍
常用两种方法： ①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DN
分子克隆技术在医学方面的应用
利用分子克隆技术已将胰岛素，人、牛和鸡的生长激素、人的干扰素、松弛素、促红细胞生长激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用发酵工业进行了大规模生产。还可提高微生物本身所产生的蛋白酶类和抗生素类药物的产量。
小分子药物单克隆抗体制备
在单克隆抗体制备中，首先进行的就是抗原的设计与合成，这是制备单抗成功与否的关键。因为产生抗体的特异性与亲合性是与抗原密切相关的，合成的抗原如果可以将所需要的抗原决定簇充分暴露出来，那么机体更容易识别抗原决定簇，从而免疫的动物所产生的抗体自然会在特异性和亲合力上最大程度的与抗原决定簇拟合。所以，在制备
分子克隆化DNA片段与载体连接介绍
DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有： ①粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。 ②平头末端连接，用物理方法制备的DN
CRISPR/Cas9抗体—CRISPR/Cas9研究
能够方便而精确的对DNA和核苷酸序列进行编辑，是科研工作者们长期以来的梦想。CRISPR/Cas9系统的诞生和成熟标志这这一梦想逐渐变为现实。CRISPR/Cas9系统，作为第三代基因编辑技术，它的本质其实是细菌中一种对付诸如病毒等外来DNA的防御系统。此系统的工作原理是 成簇的、规律间隔的短回
清华大学张雅鸥教授：癌症小分子RNA
来自清华大学生科院，深圳研究生院，加拿大多伦多大学的研究人员分析了一种重要的癌症相关小分子RNA：miR-210在细胞周期调控中靶基因，从中发现了一系列的靶基因，并深入分析了miR-210对有丝分裂的影响，指出miR-210能干扰有丝分裂过程，这也许解释了其对肿瘤形成的抑制作用。相关成果公布在N
分子克隆实验指南第四版发售
在生命科学领域，没有一本书比它更红，几乎每个实验室都有，几乎每个人都翻过。它就是《分子克隆实验指南》。30年前，这本书诞生于冷泉港实验室出版社，它的前身是1980年冷泉港真核基因分子克隆讲习班实验方案的汇编。7年后，该书又出了第二版。当时的人们也许未曾料到，这部著作在20年的时间里竟成为指导生命
化学小分子或开启治疗性克隆新时代
1997年克隆羊多莉的诞生点燃了人们对克隆技术造福人类健康的巨大热情，然而该技术的进一步应用受到人类卵母细胞来源的限制及对胚胎破坏带来的伦理制约。北京大学生命科学学院邓宏魁教授和赵扬博士带领的研究团队，用一种非常简单且更加安全的方法，将体细胞制成多潜能性干细胞。这一技术手段避免了上述风险，将极大
7年分子克隆经验总结
做了快7年的分子克隆，从加样加不好，到现在轻松PCR，我想分子生物学这块还是有很多经验可以分享一下的。或许很多人会说分子克隆过程中出现问题最多的大概就是连接了，大家抱怨的也最多，我也陷入在个步骤上很久。经过长时间的摸索我在连接这个问题上有一些体会，我认为连接的问题多集中在连接的体系、DNA的用量、v
分子克隆实验DNA片段与载体连接方法介绍
DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头
CRISPR/Cas9蛋白切割DNA过程中的调控和校验机制
清华大学生命科学学院陈春来研究组在《Cell Reports》杂志发表了研究论文，题目为“The Conformational Dynamics of Cas9 Governing DNA Cleavage Are Revealed by Single-Molecule FRET”（利用单分子F
分子克隆技术在农业生产方面的应用
植物遗传工程对提高农作物的产量、培育新的农作物品种提供了可能。有许多外源基因导入植物获得成功。
分子克隆技术在环境保护方面的应用
在环境保护方面，人们根据需要进行基因操作，将某种微生物的基因转入另一微生物，创造一些对有害物质降解能力更强的新菌种，以分解工业污水中的有毒物质。在食品工业方面，细菌可为人类生产有价值的蛋白质、氨基酸和糖等。
分子克隆技术在工业生产方面的应用
以分子克隆技术为主体的基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，四者紧密联系、常综合利用。许多化学试剂如丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、环氧乙烷、乌头酸和水杨酸等都可能利用分子克隆技术得到产品。
分子克隆技术在基因治疗方面的应用
通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠肿瘤细胞，在温度高时可逆转为正常细胞。为治疗半乳糖血症，用带有大肠杆菌乳糖操纵子的λ噬菌体去感染半乳糖血症患者的离体培养细胞，发现这种细胞的半乳糖苷酶达到了正常水平，并确实能代谢半乳糖。
单克隆抗体技术的类型小分子抗体简介
小分子抗体顾名思义是分子量较小的抗体片段，它的抗体分子的抗原结合部位仅仅局限于重链和轻链的可变区。虽然分子很小但它既保持了亲本单抗的亲和力具有亲本单抗一样的特异性。种类主要包括:抗原结合片(Fab)抗体、Fv抗体、单链抗体、单域抗体与最小识别单位。 1.Fab抗体 Fab抗体为仅含Fab分子
研究揭示Cas9切割DNA及其被AcrIIC3抑制的分子机理
CRISPR/Cas系统是广泛存在于细菌和古菌中抵抗病毒、质粒等外源核酸的获得性免疫系统。II型的Cas9在RNA的介导下可以特异性识别、切割dsDNA，具有可编辑性，因此被广泛用作基因编辑工具。由于其重要性，Cas9被系统地研究，大量的文献报道了Cas9的原子分辨率结构、单分子测量结果、分子动
CRISPR/Cas9－技术介绍
优秀的基因编辑技术CRISPR/Cas9基因编辑技术深受研究人员的喜爱，那么它为什么如此优秀呢？CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats）规律成簇间隔短回文重复；Cas9（CRISPR associated nuc