分子克隆实验引入寄主细胞的常用方法
常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大，转化困难。②转导，病毒类侵染宿主菌的过程称为转导，一般转导的效率比转化高。......阅读全文
分子克隆实验引入寄主细胞的常用方法
常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比
关于分子克隆化引入寄主细胞的介绍
常用两种方法： ①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DN
分子克隆常用技术
一、核酸的纯化 在分子克隆的所有操作中，最基本的操作是核酸的纯化。其关键步骤是去蛋白质，通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。每当需要把克隆有某一些所用的酶灭活或去除以便进行下一步时，可进行这种抽提。然而，如要从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化核酸，则要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后
分子克隆常用载体
分子克隆常用载体 DNA片段的克隆需要合适的载体，载体或是质粒，或是噬菌体，或是病毒，通常大多经过人工改造[地的。作为载体必须具备两条件：一是该载体在细胞内必须能自主复制，即必须具备复制原点；二是该载体必须具备适合的酶切位点，且这些酶切位点不在复制原点区域内。以上两条，保证了载体的可繁殖性和可利用
分子克隆的常用载体
DNA片段的克隆需要合适的载体，载体或是质粒，或是噬菌体，或是病毒，通常大多经过人工改造[地的。作为载体必须具备两条件：一是该载体在细胞内必须能自主复制，即必须具备复制原点；二是该载体必须具备适合的酶切位点，且这些酶切位点不在复制原点区域内。以上两条，保证了载体的可繁殖性和可利用性。为了便于获得阳隆
分子克隆的常用载体介绍
DNA片段的克隆需要合适的载体，载体或是质粒，或是噬菌体，或是病毒，通常大多经过人工改造[地的。作为载体必须具备两条件：一是该载体在细胞内必须能自主复制，即必须具备复制原点；二是该载体必须具备适合的酶切位点，且这些酶切位点不在复制原点区域内。以上两条，保证了载体的可繁殖性和可利用性。为了便于获得阳隆
分子克隆（molecular－coloning）常用技术
一、核酸的纯化在分子克隆 的所有操作中，最基本的操作是核酸的纯化。其关键步骤是去蛋白质，通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。每当需要把克隆 有某一些所用的酶灭活或去除以便进行下一步时，可进行这种抽提。然而，如要从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化核酸，则要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白
基因克隆的常用方法
基因克隆的常用方法 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。
cDNA感染性克隆的概念和原理
cDNA克隆是以mRNA为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA)，再与载体DNA分子连接引入寄主细胞。每一cDNA反映一种mRNA的结构，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。特点是：①有些生物，如RNA病毒没有DNA，只能用cDNA克隆；②cDNA克隆易筛选，因为cDNA库中不包含非
分子克隆的技术方法
在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。
分子克隆实验DNA片段与载体连接方法介绍
DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头
分子克隆实验载体DNA的选择
①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松弛型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的
几种基因克隆的常用方法介绍（一）
基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。1 根据已知序列克隆基因对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最
几种基因克隆的常用方法介绍（二）
3.2 Differential display PCR(DD-PCR) DD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RT-PCR方法,主要用于 2种或多种类似生物个体在基因表达上的差异分析。其基本原理是:所有真核生物的成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列,根据poly+ (
分子克隆蛋白表达实验指南（四）
7. PCR产物与TA载体连接 pGEM-T vector is T-tailed at the insert site. To improve the ligation efficiency, it is recommended PCR product be A-tailed. +A s
分子克隆蛋白表达实验指南（十二）
– Note: The yield of fusion protein can be estimated by measuring the absorbance at 280 nm. The GST affinity tag can be approximated by 1 A280 Å 0.5
分子克隆蛋白表达实验指南（十九）
Desired pH Volume of 1M K2HPO4 (mL)Volume of 1M KH2PO4 (mL) 5.8 8.591.5 6.0 13.286.8 6.2 19.280.8
分子克隆蛋白表达实验指南（十四）
RbCl制备感受态细胞 需准备的灭菌器具和培养液： SOB，Buffer 1，Buffer 2，3×200ml广口瓶，1.5ml EP管，1×500ml离心瓶（按200ml摇菌量计算），2×50ml离心管，2×移液管（用于加Buffer 1），液氮，冰 离心管，EP管，移液管使用前均需要放
分子克隆蛋白表达实验指南（二）
取DEPC水时切记带上手套 Genequant使用方法： 开机－set-up－enter(只更改DNA/RNA，看光波是否为320nm)－set-ref(此时插入空白对照)－样品 1．使用前将比色皿中水吸出，用1ml蒸馏水重新洗涤再将比色皿中的水吸尽（先用1ml枪吸，后用100ul枪吸）
分子克隆蛋白表达实验指南（一）
目的基因克隆包括保存用全长基因(gene for saving, GS)和表达用全长基因(gene for expression, GE)两部分。 这两部分所克隆的基因都是全长片段，但克隆的策略及目的不同。直接用精确克隆(及引物从基因CDS两端开始)很难找到高效价的引物，且cDNA中目的基
分子克隆蛋白表达实验指南（十五）
LB固体培养基 Tryptone 1g Yeast Extract 0.5g NaCl 1g Agar 1.5g 加蒸馏水至总体
分子克隆蛋白表达实验指南（十七）
Buffers for His purification in denatured conditions: 配制时加终体积50％的水，之后定容至所需体积。先配pH 8.0的buffer(调pH需要较多NaOH)，再统一配bufferC，D，E，分别调pH Buffer B (200ml
分子克隆蛋白表达实验指南（六）
10. 测序 突变后氨基酸序列没有变化仍可用于表达。测序报告中blast时若有‘－’符号，则人工对照测序图谱。 测序验证后没有突变或者同义突变的重组质粒必须小抽，50ul，conc300ug/ml备份。测序文件应妥善保存，蛋白表达完成后一并提交存档。 获得GS后，即可构建含GE的重组T载体，用
分子克隆蛋白表达实验指南（十八）
15％胶 水1.11.872.33.43.854.65.76.99.211.5 30％聚丙烯酰胺混合液2.54.2557.58.751012.5152025 1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.
分子克隆蛋白表达实验指南（五）
8. TA质粒转化菌落的验证 与表达载体的验证不同，转化TA质粒时不用双酶切验证。只需用目的基因引物和TA载体引物PCR验证即可。TA载体引物PCR片段比插入片段大约长150bp。 目的基因退火温度与之前胶回收时温度相同，TA退火温度60C即可，但可在55～70之间变动，不会影响结果。 挑取至
分子克隆蛋白表达实验指南（十三）
7． 电泳结束后，按比例从胶上割下相应约1cm条带（当按比例的条带割下后可相应的向两边再割一点，但是电透析时中间和两边的胶必须分开透析），用镊子或尺子将胶碾碎成2mm见方的小块。 8． 将碎块小心加入电透析tube中，200V，120～150min。 9． 移出放电透析tube的架子，
分子克隆蛋白表达实验指南（七）
目的基因表达 14．快速诱导表达 快速诱导目的是为检测该重组质粒在BL21中是否能被诱导表达重组蛋白，并确定在不同IPTG浓度蛋白诱导效率的差异。 5． 挑单克隆菌落于7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml培养管中，37C振荡培养过夜（8-16h）。 6． 37C，1mM
分子克隆蛋白表达实验指南（十六）
Amp(50mg/ml) 溶解1g Amp于足量的水中，最后定容至20ml。分装成小份于-20℃贮存。常以20～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基，1:1000比例稀释 Kan(50mg/ml) 溶解1g Kan于足量的水中，最后定容至20ml
分子克隆蛋白表达实验指南（三）
若有非特异性条带，可进行Touchdown PCR，提高引物的特异性。 PCR反应条件： 1 94C 5min 2 94C 45s 3 65C 45s 退火温度视
分子克隆蛋白表达实验指南（十一）
SDS-PAGE胶样品排列： MarkerUII 37CUI’I’ Marker：低分子量蛋白marker，上样10ul UI：未诱导菌液，上样10ul。任取37C和20C中一个 I：诱导后对照，上样10ul UI’, I’代表G