分子克隆蛋白表达实验指南(六)
10. 测序 突变后氨基酸序列没有变化仍可用于表达。测序报告中blast时若有‘-’符号,则人工对照测序图谱。 测序验证后没有突变或者同义突变的重组质粒必须小抽,50ul,conc300ug/ml备份。测序文件应妥善保存,蛋白表达完成后一并提交存档。 获得GS后,即可构建含GE的重组T载体,用于表达。GE T载体的构建与GS T载体构建步骤相同(GS的引物需加酶切位点和保护碱基) 若序列正确,应及时保存相应的质粒及细菌(DH5α)。保存要求:小抽质粒50ul,细菌0.6~1.0ml于30%甘油中。 菌种保存及复苏 保存: 在0.6ml过夜培养物中加入0.2ml灭菌的60%甘油。Vortex以确保甘油分散均匀。置于-70C保存 复苏: 用灭菌的接种环刮拭冻结的培养物表面,立......阅读全文
分子克隆-蛋白表达实验指南(六)
10. 测序 突变后氨基酸序列没有变化仍可用于表达。测序报告中blast时若有‘-’符号,则人工对照测序图谱。 测序验证后没有突变或者同义突变的重组质粒必须小抽,50ul,conc300ug/ml备份。测序文件应妥善保存,蛋白表达完成后一并提交存档。 获得GS后,即可构建含GE的重组T载体,用
分子克隆-蛋白表达实验指南(十八)
15%胶 水1.11.872.33.43.854.65.76.99.211.5 30%聚丙烯酰胺混合液2.54.2557.58.751012.5152025 1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.
分子克隆-蛋白表达实验指南(十五)
LB固体培养基 Tryptone 1g Yeast Extract 0.5g NaCl 1g Agar 1.5g 加蒸馏水至总体
分子克隆-蛋白表达实验指南(十七)
Buffers for His purification in denatured conditions: 配制时加终体积50%的水,之后定容至所需体积。先配pH 8.0的buffer(调pH需要较多NaOH),再统一配bufferC,D,E,分别调pH Buffer B (200ml
分子克隆-蛋白表达实验指南(十二)
– Note: The yield of fusion protein can be estimated by measuring the absorbance at 280 nm. The GST affinity tag can be approximated by 1 A280 Å 0.5
分子克隆-蛋白表达实验指南(十九)
Desired pH Volume of 1M K2HPO4 (mL)Volume of 1M KH2PO4 (mL) 5.8 8.591.5 6.0 13.286.8 6.2 19.280.8
分子克隆-蛋白表达实验指南(十四)
RbCl制备感受态细胞 需准备的灭菌器具和培养液: SOB,Buffer 1,Buffer 2,3×200ml广口瓶,1.5ml EP管,1×500ml离心瓶(按200ml摇菌量计算),2×50ml离心管,2×移液管(用于加Buffer 1),液氮,冰 离心管,EP管,移液管使用前均需要放
分子克隆-蛋白表达实验指南(十三)
7. 电泳结束后,按比例从胶上割下相应约1cm条带(当按比例的条带割下后可相应的向两边再割一点,但是电透析时中间和两边的胶必须分开透析),用镊子或尺子将胶碾碎成2mm见方的小块。 8. 将碎块小心加入电透析tube中,200V,120~150min。 9. 移出放电透析tube的架子,
分子克隆-蛋白表达实验指南(十一)
SDS-PAGE胶样品排列: MarkerUII 37CUI’I’ Marker:低分子量蛋白marker,上样10ul UI:未诱导菌液,上样10ul。任取37C和20C中一个 I:诱导后对照,上样10ul UI’, I’代表G
分子克隆-蛋白表达实验指南(十六)
Amp(50mg/ml) 溶解1g Amp于足量的水中,最后定容至20ml。分装成小份于-20℃贮存。常以20~50ug/ml的终浓度添加于生长培养基,1:1000比例稀释 Kan(50mg/ml) 溶解1g Kan于足量的水中,最后定容至20ml