细菌细胞的制备实验实验——细胞抽提物的制备
实验材料细胞试剂、试剂盒弗氏破碎缓冲液匀浆缓冲液仪器、耗材弗氏破碎器实验步骤1. 将 5~10 g 新鲜或冻存的细胞沉淀物垂悬于弗氏破碎缓冲液中或者适当的匀浆缓冲液中。通常 4L 的大肠杆菌培养物可以获得大约 7.5 g 的细胞沉淀。2. 悬液中加入无 RNase 的 DNase 至终浓度为 2 μg/ml 并在 4℃ 中放置 20 分钟。3. 细胞破碎：(1) 真细菌的 70S 核糖体弗氏破碎缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.550 mmol/L MgOAc100 mmol/L NH4Cl1.0 mmol/L DTT0.5 mmol/L EDTA细胞在弗氏破碎器中以每平方英寸 16000 磅的压力破碎 1 分钟。(2) 真细菌多核糖体弗氏破碎缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.650 mmol/L MgCl2150 mmol/L NH4CI细胞在弗氏破碎器中以每平方英寸 13800 磅......阅读全文
细菌细胞的制备实验实验——细胞抽提物的制备
实验材料细胞试剂、试剂盒弗氏破碎缓冲液匀浆缓冲液仪器、耗材弗氏破碎器实验步骤1. 将 5~10 g 新鲜或冻存的细胞沉淀物垂悬于弗氏破碎缓冲液中或者适当的匀浆缓冲液中。通常 4L 的大肠杆菌培养物可以获得大约 7.5 g 的细胞沉淀。2. 悬液中加入无 RNase 的 DNase 至终浓度为 2 μ
细菌细胞的制备实验实验
细胞抽提物的制备 核糖体及多核糖体的分离 70S核糖体的纯化 多核糖体的纯化 将核糖体解离为大亚基和小亚基 实验材料
细菌细胞的制备实验实验
细胞抽提物的制备核糖体及多核糖体的分离70S核糖体的纯化多核糖体的纯化将核糖体解离为大亚基和小亚基实验材料细胞 试剂、试剂盒弗氏破碎缓冲液
细菌细胞的制备实验实验
实验材料 细胞试剂、试剂盒 弗氏破碎缓冲液匀浆缓冲液仪器、耗材 弗氏破碎器实验步骤 1. 将 5~10 g 新鲜或冻存的细胞沉淀物垂悬于弗氏破碎缓冲液中或者适当的匀浆缓冲液中。通常 4L 的大肠杆菌培养物可以获得大约 7.5 g 的细胞沉淀。2. 悬液中加入无 RNase 的 DNase 至终浓度为
果蝇－S190－染色质重组抽提物的制备实验
实验材料0～6 h 果蜗胚胎试剂、试剂盒脱色洗液胚胎洗液盐洗液缓冲液 RMgCl2液氮仪器、耗材细尼龙网玻璃烧杯锥形管玻璃棒塑料注射器真空吸气机Wheaton 杜恩斯匀浆器Sorvall Superspeed 离心机Beckman 超速离心机实验步骤1. 试剂准备：脱色洗液：50％（V/V）家用漂白
果蝇－S190－染色质重组抽提物的制备实验
实验方法原理 实验材料 0～6 h 果蜗胚胎试剂、试剂盒 脱色洗液胚胎洗液盐洗液缓冲液 RMgCl2 液氮仪器、耗材 细尼龙网玻璃烧杯锥形管玻璃棒塑料注射器真空吸气机Wheaton 杜恩斯匀浆器 Sorvall Superspeed 离心机Beckman 超速离心机实验步骤 1. 试剂准备：脱色洗液
细胞和亚细胞提取物的制备实验
方案1 哺乳动物组织的匀浆实验 方案2 用于免疫沉淀的培养细胞的裂解实验 方案3 用于免疫印迹的动物培养细胞、酵母和细菌的裂解实验 方案4 氮舱减压法裂解培养细胞实验 方案5 细菌中重组蛋白的小量提取实验 方案6 细菌中重组蛋白的
细胞和亚细胞提取物的制备实验
实验方法原理 对于细胞内蛋白的纯化和特性分析，重要的是选择一种有效的方法来破碎细胞或组织，使蛋白迅速地从胞内相对隔离的空间中释放到缓冲液中，而该缓冲液应对所研究的蛋白的生物活性没有影响。广泛使用的破碎软组织的方法之一是勻浆。在本方案中，讨论了使用机械力匀浆组织：在 Potter-Elvehjem
细胞和亚细胞提取物的制备实验
从组织和细胞中提取蛋白可能是蛋白质组研究中最关键的一步，因为这一步影响了蛋白的产率、生物活性和特定目的蛋白结构的完整性。因此，我们要注意蛋白提取条件的选择。主要目标是在破坏力最小、保持蛋白结构完整性的前提下，可重复地使细胞最大程度地裂解。方案1 哺乳动物组织的匀浆实验实验方法原理对于细胞内蛋白的纯化
细胞和亚细胞提取物的制备实验3
方案3 用于免疫印迹的动物培养细胞、酵母和细菌的裂解实验实验方法原理去垢剂裂解细胞法通常用于培养的动物细胞。典型的离子型去垢剂SDS(如2%SDS)能充分地裂解细胞。培养的动物细胞和细菌，如可以使用这种方式裂解。假如实验所用的抗体识别的抗原决定簇取决于自然空间构象，并对还原环境敏感，那么在裂解缓冲液
细胞和亚细胞提取物的制备实验6
方案6 细菌中重组蛋白的大量提取实验实验方法原理利用细菌获得用于纯化的重组蛋白是非常方便的。适用于细菌细胞蛋白提取的方法包括超声波处理、玻璃珠研磨、钒土或石英砂研磨、French 加压罐高压剪切细胞和溶’菌酶处理。这些方法适用于从各种革兰阴性菌和革兰阳性菌中制备蛋白提取物。通常是使用酶的方法破坏细胞
细胞和亚细胞提取物的制备实验7
方案7 从包含体中溶解大肠杆菌重组蛋白实验实验方法原理由于分子克隆技术能够使细菌高水平表达蛋白，因此原核表达是一个非常便利的获得重组蛋白的系统。遗憾的是这些蛋白在细菌中易于聚合和沉淀，形成难溶解的包含体，因而很难纯化。非细菌蛋白的包含体尤其普遍。虽然没有一种可用于所有蛋白的普适方法，还是有许多策略适
细胞和亚细胞提取物的制备实验8
方案8 酵母提取物的制备实验实验方法原理由于酵母的经典遗传分析和分子遗传分析都已经研究得非常透彻，因而对于纯化重组动物蛋白来说，酵母是一个很有吸引力的表达体系。关于培养和收集酵母细胞的讨论，尤其是芽殖酵母，参见 Jazwinski(1990)。酵母细胞的裂解方法有很多种，包括自溶、压力破碎（如 Fr
细胞和亚细胞提取物的制备实验5
方案5 细菌中重组蛋白的小量提取实验实验方法原理利用细菌获得用于纯化的重组蛋白是非常方便的。为了检测诱导和重组蛋白的表达水平，评估方法的快速简单是很重要的。本方案使用 0.5% TritonX-1OO 裂解细胞，小量制备细菌提取物。实验材料表达目标重组蛋白的细菌细胞试剂、试剂盒二硫苏糖醇（DTT)样
细胞和亚细胞提取物的制备实验2
方案2 用于免疫沉淀的培养细胞的裂解实验实验方法原理培养的动物细胞一般使用温和去垢剂来裂解。如果低浓度的去垢剂就能引起细胞的充分裂解（如 l%NP-40 或 l%Triton X-100)，那么这对目标蛋白的影响可能比方案 1 中所讨论的匀浆方法更温和。去垢剂的选择必须根据免疫沉淀所用的抗体的识别表
细胞和亚细胞提取物的制备实验4
方案4 氮舱减压法裂解培养细胞实验实验方法原理通过来自增压舱中的氮气减压膨胀来破碎细胞是一种快速、有效的细胞和组织的匀浆方法，能释放完整的细胞器和制备细胞膜（Hunter and Commerford，1961)。该方法的原理很简单：细胞放在一个压力舱中，在高压下（约5500kPa，相当于800ps
细胞和亚细胞提取物的制备实验9
实验方法原理差异去垢剂分离法（differential detergent fractionation, DDF) 包括使用一系列含不同去垢剂的 PIPES 缓冲液对细胞进行连续抽提，首先是毛地黄皂苷，其次是 Triton, 最后是 Tween/脱氧胆酸盐。这些步骤产生 4 种在生化和电泳上相异的组
细菌细胞的制备实验实验——多核糖体的纯化
实验材料真细菌多核糖体植物多核糖体试剂、试剂盒多核糖体蔗糖梯度缓冲液蔗糖梯度缓冲液实验步骤一、真细菌多核糖体1. 含有多核糖体（每管 0.6 ml ) 的上清铺到 15%~30% 蔗糖梯度的上面，在该蔗糖梯度的下面为 0.5 ml 的 60% 蔗糖铺垫液，内含如下缓冲液：多核糖体蔗糖梯度缓冲液：20
培养细胞标记和裂解物的制备实验
实验材料 培养细胞试剂、试剂盒 DMEMHClTBSTris仪器、耗材 微量离心管Plexiglas盒吸头细胞刮子冷冻离心机实验步骤 1. 培养待标记的细胞至适当的生长期。 对于贴壁细胞： 2a. 吸去培养液，用37℃的含血清不加标记物的标记培养液洗尽残存的含磷酸盐培养液，吸尽该培养液。 3a.
培养细胞标记和裂解物的制备实验
温和去污裂解法 SDS煮沸法 实验材料 培养细胞 试剂、试剂盒
HeLa－细胞核提取物的制备实验
试剂、试剂盒 甘油液氮MgCl2•6 H2O硫酸铵HeLa 细胞磷酸缓冲盐溶液（PBS) 缓冲液 G缓冲液 H 缓冲液 DTM 缓冲液+0.1 ml L KCl实验步骤 材料HeLa 细胞（培养和保存条件见下文。我们也成功地使用过 CellexBiosciences 公司制备并冷冻的 HeLa 细胞
培养细胞标记和裂解物的制备实验
温和去污裂解法 SDS煮沸法 实验材料 培养细胞 试剂、试剂盒
HeLa－细胞核提取物的制备实验
在本实验中，基本上是按Dignam等（1983)所述的方法从HeLa细胞制备核提取物的。这一基本方法大概是制备体外转录和DNA结合实验用因子的最常用的方法。本实验来源于蛋白质纯化与鉴定实验指南，作者：朱厚础。试剂、试剂盒甘油液氮MgCl2•6 H2O硫酸铵HeLa 细胞磷酸缓冲盐溶液（PBS)缓冲液
细菌RNA制备实验
实验材料 RNA试剂、试剂盒 STET氯仿乙酸钠氯化铯无水乙醇EDTA仪器、耗材 离心机分光光度计摇床实验步骤 1. 培养100 ml 大肠杆菌或500 ml 蓝细菌至对数生长期，加入1/20体积终止缓冲液，置于冰上。2. 于4℃用JA-10转子17 700 g 离心5 min 收集细胞。3.
细菌RNA制备实验
革兰氏阴性细菌中提取 革兰氏阳性细菌中提取 实验材料 RNA 试
细菌细胞的制备实验实验——70S核糖体的纯化
实验材料核糖体试剂、试剂盒致密偶联缓冲液仪器、耗材Beckman Vti50 转头实验步骤1. 采用 Beckman Vti50 转头和 7% 至 30% (w/v) 的线性蔗糖梯度沉降来纯化 70S 真细菌的核糖体。这一步可以确保大的蛋白质聚集物不会与 70S 核糖体一起沉淀下来。并可以产生致密偶
哺乳动物细胞抽提物中荧光素酶的测定实验
实验材料 用感兴趣的 DNA 转染的哺乳动物培养细胞试剂、试剂盒 细胞裂解缓冲液荧光素酶测定缓冲液荧光素溶液不含钙盐和镁盐的磷酸盐缓冲液仪器、耗材 荧光光度计和光度计测置管橡胶棒实验步骤 材料缓冲液和溶液贮存液稀释到适当浓度。细胞裂解缓冲液25 mmol/L 双甘氨肽（pH7.8)15 mmol/L
细胞膜的制备方法实验——从悬浮细胞中制备细胞膜
实验材料胶原酶试剂、试剂盒EDTAHBSS胶原酶溶液阳离子硅胶贮存液仪器、耗材离心机实验步骤一、用胶原酶/EDTA 释放细胞1. 用预保温溶液洗涤单层细胞并用胶原酶处理(1) 预保温溶液洗涤细胞。预保温溶液：5 mmol/L EDTA 钠盐溶于 HBSS，不含二价阳离子。(2) 在单层细胞上加 1%
细胞膜的制备方法实验
从悬浮细胞中制备细胞膜 从组织培养皿中的汇合或部分汇合细胞中分离顶层膜、基底膜或中间膜 从生长于微载体上的细胞中分离细胞膜 实验材料
细胞膜的制备方法实验
从悬浮细胞中制备细胞膜从组织培养皿中的汇合或部分汇合细胞中分离顶层膜、基底膜或中间膜从生长于微载体上的细胞中分离细胞膜实验材料胶原酶 试剂、试剂盒EDTA