从G418筛选,转染到单克隆化的总结

我做了稳定转染,从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方,大家补充。筛选之前确定G418浓度:1,由于每种细胞对G418的敏感性不同,而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同,一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。2,G418是新霉素的类似物,两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因,它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。在进行转染时细胞膜受到影响,抗生素可能对细胞产生较大影响,加上G418有杀菌作用,所以有人主张转转染时不加其它抗生素。3,汇合度对G418筛选结果的影响很大,一般筛选时汇合度不宜超过50% 4,G418的活性不尽相同,所以在筛选之前,一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下:将细胞稀释到1000个细胞......阅读全文

筛选到的靶分子结合肽的ELISA检测

实验概要本实验对筛选到的靶分子结合肽进行了ELISA检测。主要试剂1. LB培养基2. PEG/NaCl3. TBS4. 0.1M NaHCO3(pH8.6)5. HRP底物缓冲液6. ABTS贮存液:在100ml 50mM的柠檬酸钠溶液(pH4.0)中溶解22mgABTS,过滤除菌贮存在4℃。主要

生物燃气:从“池”到“链”的转型

德青源公司移动式沼气提纯站。 德青源生物燃气工程项目现场。 北京市延庆县前黑龙庙村村民在使用生物燃气烧饭。   “一年好,二年差,三年四年养青蛙。”曾是农民调侃自家沼气池的顺口溜。现如今,沼气池因技术不精、管理不好而养出一池青蛙的现象已成过去,一条依靠科技与商业模式创新双轮驱动的生物燃气产业“

“从0到1”,高校的机遇何在

  科研工作是从0→1→无穷大的持续接力过程,但“从0到1”无疑最重要、最基本,因为它意味着无中生有、前无古人,也意味着原始创新。  然而,开展“从0到1”的基础研究,目前高校尚存在一些问题。  首先是大胆假设、勇于猜想不足。  基础研究特别是自然科学领域的研究要敢于假设、提出猜想。大胆猜想、小心求

Pichia酵母表达系统操作方法

我先说我有的质粒和菌株:PPIC9K,PPIC9,PPICZahphaA,B,C以及一个改造的PPIC9K载体,EcoRI和BamHI双酶切,C末端引入了一个6histag菌株:GS115,KM71,X33,以及十几个空载体对照菌株我的酵母表达Protocol:>10ug质粒用Sal线性化,加1/1

探索从细胞到微孔板到动物的成像技术发展

探索从细胞到微孔板到动物的成像技术发展-《科学》杂志网络研讨会系列 《科学》杂志网络研讨会系列: 探索从细胞到微孔板到动物的成像技术发展。 请于 12 月 7 日在线参加我们的网络研讨会:探索治疗疾病的新药物:小动物活体成像技术在新药研发中的最新应用

从“降压治疗”到“血压管理”(二)

  2 高血压的治疗    2.1 降压目标    高血压的治疗目标既所谓达标是近年来人们最关心的问题,较早关注血压目标值的大型试验是HOT研究,发现舒张压降至83mmHg左右为宜,当时没有重视收缩压。后来将一般的高血压患者的达标标准定为小于140/90mmHg,对于糖尿病和肾脏疾病患者一般推荐

从免疫印迹到抗体纯化

一、材料和试剂 1.  PVDF或硝酸纤维素膜(Amersham,GEhealthcare)2.  透析袋(PierceCat#68035)3.  丽春红S(Sigma,Cat#P7170)4.  脱脂奶粉(Carnation,any your favorite brand in local st

从“包办婚姻”到“幸福婚姻”

  技术交流会结束后,赛默飞世尔科技公司安排了媒体问答环节。赛默飞世尔科技中国区市场总监毛君玲女士、色谱质谱市场经理王勇为博士、戴安产品中国商务运营总监杜平先生、戴安产品销售/服务分管副总经理梁晓峰先生、戴安产品市场部经理刘静女士对媒体提出的问题进行了详细的回答。 媒体

抗衰老研究:从基因到药物

 自古以来,人类就追求青春常在,生命不老,历史上曾出现过许多寻找“长生不老”秘方以及炼制“仙丹灵药”的活动。时至今日,人们 已认识到“长生不老”只是一个美梦,但是延缓衰老却是可能实现的,寻找抗衰老药物的脚步一直没有停息。随着科学技术的进步,科研的触角已经深入到了基因水平,进而发现了更多药物的抗衰老作

从“降压治疗”到“血压管理”(三)

  4 围手术期的血压管理    围手术期血压过高和过低都是手术并发症和死亡的独立危险因素,在术前将血压控制在什么水平更安全、如何避免术前、术中和术后的血压过高和过低等问题都需要我们考虑。应当根据患者手术的急迫性、患者的术前血压情况、患者的靶器官损害情况综合考虑,对高血压患者应当在术前进行详细评

从恐龙到鸟,为何演化变慢?

生命演化史上有一些重要的节点事件,比如颌的出现,鱼类登上陆地,爬行动物飞上蓝天等等。过去,科学家理所当然地认为,当这类具有“演化革新”意味的特征或者形态功能在某一类群中刚刚出现时,该类群的演化速率会变快,多样性也会增加。原因是,这些“革新”能够帮助生物快速进入新的生态位。中国科学院古脊椎动物与古人类

从“降压治疗”到“血压管理”(一)

  高血压已经成为威胁人类健康和生命的最常见的慢性心血管疾病,中国的高血压患者已经超过2亿人,高血压可以带来严重的并发症而导致死亡与残废,并且由于高血压早期可能没有任何症状而延误治疗,因此,高血压又被称为“无声杀手”。由于高血压的危害已经被认识,并且降压治疗的益处又被许多大型临床试验所证明,所有

怎样从土壤中筛选微生物

原理: 目前尚无一种培养基可以养出所有的微生物,但我们可以设计一种培养基,其组成份适合所要分离的微生物,而不利其他微生物的生长,如此一来,即使我们想分离的微生物为数不多,也可以将它们分离出来,这就是选择性培养基。本实验就是使用选择性培养基来分离土壤微生物,并计数它们的数量以及观察在不同的选择性培养基

细胞同步化的方法总结

问:在培养细胞取材做其他检测时,为了各个培养瓶中的细胞的齐同性,常须通过同步而实现。具体方法不明,好象是用维持培养液(含较低浓度培养血清),而不是用生长培养液。答:1.细胞同步化是指为研究细胞周期的不同阶段的生化特征,必须获得细胞周期一致性的细胞.因此,你首先看看是否需要用同步化的细胞2.细胞同步化

单克隆酶免疫色度分析筛选方法需要哪些仪器?

①微量条板架  能放置1~8个微量条板的聚苯乙烯框架。②条板密封纸  覆盖微量板的粘合纸。③内嵌式包装物  (用于固定放置试剂)。④培养箱  能于35.0℃±0.1℃~37.0℃±0.1℃恒温。⑤水浴箱a.能于42.0℃±0.5℃和35.0℃±1.0℃恒温。b.能于100.0℃±0.1℃恒温。(注意

单克隆抗体杂交瘤细胞筛选技术介绍

1986年,美国FDA批准了第一个单克隆抗体药物上市,距今已快30年。目前,全世界共有超过40个治疗用抗体药物被批准上市,每年实现超过600亿美元的销售额。在国际及国内形成了抗体药物开发热潮。巨大的市场前景和现存的技术问题及壁垒并存的现实不可避免地引发抗体药物新一轮技术革命。而其结果又将毫无疑问地改

百万千瓦级核电设备国产化之路:从1%到85%的跃升

  图为中广核设备监造人员正在对东方电机集团制造的岭澳二期核电站发电机定子进行检查。图为东方电气集团为中广核核电项目制造的汽轮机转子。 赖虔瑜摄  中广核正是通过全产业的协同创新模式,与产业链上下游的企业形成产业联盟关系,从而促进了核电站的建设和核电技术的发展,还极大地促进了我国装备

基因转染(磷酸钙DNA共沉淀法)

基因转染技术可以应用于:基因组功能研究(基因表达调控,基因功能,信号转导和药物筛选研究)和基因治疗研究。实验方法原理核酸以磷酸钙-DNA 共沉淀物的形式出现时,可使DNA 附在细胞表面,利于细胞吞入摄取,或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内,进入细胞的DNA 仅有1%~5%可以进入细胞核中,其

从结绳记事到集成电路,复旦学院让信息科学具象化

5月21日,在复旦大学江湾校区二号学科交叉楼,信息科学与工程学院微纳系统中心举办了“科研科普融合创新基地”落成开放日。开放日现场,微纳系统中心教授仇志军讲解了科研科普融合创新基地(以下简称科研科普创新基地)布局和特色。科研科普创新基地依托微纳系统中心的大型超净实验室,集科研与科普功能为一体。科研科普

医学检验:从样本到报告的奇妙旅程

  在医学的广阔天地里,检验医学如同一座精密的桥梁,连接着疾病的诊断与治疗。它不仅仅是简单的“抽个血、化验一下”,而是一场从样本采集到报告解读的奇妙旅程。这场旅程中,每一个步骤都蕴含着科学与技术的结晶,每一步都至关重要,共同编织了一张精准诊断的网络。  一、样本采集:旅程的起点  一切始于样本的采集

从科学的春天到建设创新型国家

全国人大常委会副委员长、中国科学院院长 路甬祥 1978年3月18日,中共中央在北京隆重召开的全国科学大会,实际上不仅是对科技界的拨乱反正,也是我国改革开放的先声。时任中国科学院院长、86岁高龄的郭老在大会闭幕式上,满怀激情地说:“这是革命的春天,这是人民的春天,这是科学的春天!让我们张开双臂,热

从赶上时代到引领时代的伟大跨越

   中国要强盛、中华民族要复兴,就一定要大力发展科学技术,努力成为世界主要科学中心和创新高地。改革开放40年来特别是党的十八大以来,在党中央坚强领导下,经过全国科技界和社会各界的共同努力,我国科技事业密集发力、加速跨越,实现了历史性、整体性、格局性重大变化。科技研发开始由跟跑转向并行、领跑,基础研

潮霉素B性质及应用

潮霉素B(HygromycinB )是由吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素,通过抑制蛋白质合成而杀死细菌、真菌和高等真核细胞。潮霉素B通过干扰70S核糖体易位和诱导对mRNA模板的错读而抑制蛋白合成。目前常用于筛选和维持培养含潮霉素抗性基因

如何从土壤中筛选所需的放线菌

放线菌主要存于土壤并土壤占相比例般放线菌比较干燥、偏碱性、含机质丰富土壤数量居通随着理布、植及土壤性质同放线菌种类、数量拮抗性各相同土壤微物本营其放线菌链霉菌主通除链霉菌外其放线菌统称稀放线菌若规进行离几乎全部链霉菌采用加热处理土、选用特殊培养基或添加某种抗素等均提高稀放线菌获率由土壤离放线菌其包括

单克隆抗体技术的方法细胞筛选操作过程

杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选,即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来,通常也称为抗体检测。抗体检测的方法很多,通常根据所研究的抗原和 实验室的条件而定。但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、准备、简便,便于一次处理大量样品等特点。因为往往有几百个样品需要在短短几个小时就报 告结果,

磷酸钙介导的高分子量基因组-DNA-转染细胞实验

下述方法是对 Graham 与 Van der Eb(1973) 建立的磷酸转方法的改进,用高分子量基因组 DNA 代替了质粒 DNA。这一方法对建立稳定的携带补充宿主染色体基因突变的转染基因的细胞系尤其有用(Segeetal.1984,Kingsley et al.1986)。本实验来源于分子克隆

DNA重组(DNA-recombination)技术:外源基因的蛋白表达3

(6)遗传标记: 从成千上万个哺乳细胞中,检测出极少数的含DNA重组体的转染细胞,并鉴定已导入外源DNA是哺乳动物细胞基因表达系统的一个关键内容。因此,在真核生物表达载体上必须附有标记基因,才能进行筛选。常用的标记基因有:胸苷激酶基因(thymidine kinase,TK)、二氢叶酸还原酶

从“污水靠蒸发”到“清水绕人家”

  农村生活污水是当前农村人居环境整治的突出短板,记者最近在黑龙江、河北、湖北、广东采访发现,当地坚持因地制宜、分类施策,实现从“污水靠蒸发”向污水变清水、清水带“红利”的局面发展。  因地制宜,分类施策  邯郸市峰峰矿区位于河北省南部,既是老工矿区、又是一级水源保护地,当地坚决贯彻绿水青山就是金山

饶毅:从“美国梦”到“中国梦”

  我认同的“中国梦”是在中国文化传统的根源基础上,结合中国100多年来的历程所形成的。一个世界大国、一个有悠久文化的民族,经过特定历史阶段,形成了我们独特的建国史和精神文化。100多年来,我们多方寻找、学习、探究现代中国的道路。  毋庸讳言,许多人出国的一个原因是以为美国代表了