谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白实验
实验材料 表达 GST 融合蛋白的大肠杆菌细胞 试剂、试剂盒 二硫苏糖醇 谷胱甘肽洗脱缓冲液 磷酸缓冲钠盐溶液 TritonX-100 DNase 溶菌酶 RNase 凝血酶、肠激酶或 Xa 因子溶液 SDS-聚丙烯酰胺凝胶 仪器、耗材 SorvallSS-34 转头或相当的转头 谷胱甘肽-琼脂糖树脂 皮下注射针头 ......阅读全文
有关融合蛋白表达载体的克隆
在构建融含蛋白表达载体时除了要注意插入片段的方向、读码框架与载体保持一致外，注意以下问题可能会减少一些不必要的麻烦，当外源片的插入载体起始密码的后面，另一个基因的前面时，注意检查插入后基因的两端是否引入了新的终止密码，特别是用到Klenow mung bean 核酸酶，T4 Polymerase
分子克隆蛋白表达实验指南（四）
7. PCR产物与TA载体连接 pGEM-T vector is T-tailed at the insert site. To improve the ligation efficiency, it is recommended PCR product be A-tailed. +A s
分子克隆蛋白表达实验指南（十二）
– Note: The yield of fusion protein can be estimated by measuring the absorbance at 280 nm. The GST affinity tag can be approximated by 1 A280 Å 0.5
分子克隆蛋白表达实验指南（十五）
LB固体培养基 Tryptone 1g Yeast Extract 0.5g NaCl 1g Agar 1.5g 加蒸馏水至总体
分子克隆蛋白表达实验指南（十八）
15％胶 水1.11.872.33.43.854.65.76.99.211.5 30％聚丙烯酰胺混合液2.54.2557.58.751012.5152025 1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.
分子克隆蛋白表达实验指南（五）
8. TA质粒转化菌落的验证 与表达载体的验证不同，转化TA质粒时不用双酶切验证。只需用目的基因引物和TA载体引物PCR验证即可。TA载体引物PCR片段比插入片段大约长150bp。 目的基因退火温度与之前胶回收时温度相同，TA退火温度60C即可，但可在55～70之间变动，不会影响结果。 挑取至
分子克隆蛋白表达实验指南（十三）
7． 电泳结束后，按比例从胶上割下相应约1cm条带（当按比例的条带割下后可相应的向两边再割一点，但是电透析时中间和两边的胶必须分开透析），用镊子或尺子将胶碾碎成2mm见方的小块。 8． 将碎块小心加入电透析tube中，200V，120～150min。 9． 移出放电透析tube的架子，
分子克隆蛋白表达实验指南（十四）
RbCl制备感受态细胞 需准备的灭菌器具和培养液： SOB，Buffer 1，Buffer 2，3×200ml广口瓶，1.5ml EP管，1×500ml离心瓶（按200ml摇菌量计算），2×50ml离心管，2×移液管（用于加Buffer 1），液氮，冰 离心管，EP管，移液管使用前均需要放
分子克隆蛋白表达实验指南（六）
10. 测序 突变后氨基酸序列没有变化仍可用于表达。测序报告中blast时若有‘－’符号，则人工对照测序图谱。 测序验证后没有突变或者同义突变的重组质粒必须小抽，50ul，conc300ug/ml备份。测序文件应妥善保存，蛋白表达完成后一并提交存档。 获得GS后，即可构建含GE的重组T载体，用
分子克隆蛋白表达实验指南（十六）
Amp(50mg/ml) 溶解1g Amp于足量的水中，最后定容至20ml。分装成小份于-20℃贮存。常以20～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基，1:1000比例稀释 Kan(50mg/ml) 溶解1g Kan于足量的水中，最后定容至20ml
分子克隆蛋白表达实验指南（三）
若有非特异性条带，可进行Touchdown PCR，提高引物的特异性。 PCR反应条件： 1 94C 5min 2 94C 45s 3 65C 45s 退火温度视
分子克隆蛋白表达实验指南（十）
13．连接产物转化DH5α（预开42C水浴） 与T载体转化相同，先转化DH5α，筛选及扩增目的重组质粒 转化DH5α后挑6～8个菌落验证，验证项目： 1． 目的基因引物PCR验证 2． 表达载体引物PCR验证 3． Step2中PCR产物胶回收后，以胶回收为模板、
分子克隆蛋白表达实验指南（十一）
SDS-PAGE胶样品排列： MarkerUII 37CUI’I’ Marker：低分子量蛋白marker，上样10ul UI：未诱导菌液，上样10ul。任取37C和20C中一个 I：诱导后对照，上样10ul UI’, I’代表G
分子克隆蛋白表达实验指南（二）
取DEPC水时切记带上手套 Genequant使用方法： 开机－set-up－enter(只更改DNA/RNA，看光波是否为320nm)－set-ref(此时插入空白对照)－样品 1．使用前将比色皿中水吸出，用1ml蒸馏水重新洗涤再将比色皿中的水吸尽（先用1ml枪吸，后用100ul枪吸）
分子克隆蛋白表达实验指南（一）
目的基因克隆包括保存用全长基因(gene for saving, GS)和表达用全长基因(gene for expression, GE)两部分。 这两部分所克隆的基因都是全长片段，但克隆的策略及目的不同。直接用精确克隆(及引物从基因CDS两端开始)很难找到高效价的引物，且cDNA中目的基
分子克隆蛋白表达实验指南（七）
目的基因表达 14．快速诱导表达 快速诱导目的是为检测该重组质粒在BL21中是否能被诱导表达重组蛋白，并确定在不同IPTG浓度蛋白诱导效率的差异。 5． 挑单克隆菌落于7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml培养管中，37C振荡培养过夜（8-16h）。 6． 37C，1mM
分子克隆蛋白表达实验指南（十七）
Buffers for His purification in denatured conditions: 配制时加终体积50％的水，之后定容至所需体积。先配pH 8.0的buffer(调pH需要较多NaOH)，再统一配bufferC，D，E，分别调pH Buffer B (200ml
分子克隆蛋白表达实验指南（九）
SDS-PAGE胶样品排列： MUIBS1S1P1BS2S2P2UIT1T2T3T4 M：marker；上样10ul UI：未诱导对照；10ul BS：超声前样品；10ul S：超声后上清； 10ul P：超声后沉淀； 10ul T：诱导后每隔1h样品，1
分子克隆蛋白表达实验指南（八）
15. 小量蛋白诱导表达 该步骤的目的是检测蛋白是否在上清存在表达。低温时蛋白易于表达于上清，因此小量蛋白诱导表达以20或30C为培养温度。 1. 挑一单克隆的菌落于5ml含有相应的抗生素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜（8-16h）。 2. 过夜培养液加入三瓶50ml含
分子克隆蛋白表达实验指南（十九）
Desired pH Volume of 1M K2HPO4 (mL)Volume of 1M KH2PO4 (mL) 5.8 8.591.5 6.0 13.286.8 6.2 19.280.8
分子克隆介绍
各位小伙伴，大家还记得当初进实验室的时候接触到的一个实验技能是什么呢？没错，是 PCR 扩增。小编曾经也是，看着自己亲自配比 PCR 克隆扩增的每个组分，亲眼看着琼脂糖凝胶在紫外透光台上发出的幽绿色的荧光，也是深深被迷住。但总不可能成天就对着这个邪魅的荧光发呆，对吧？看久了，她会爱上你的眼
简述分子克隆化克隆的选择
①直接筛选：有些载体带有可辨认的遗传标记，能有效地将重组分子与本底区分。例如：有些λ噬菌体携带外源基因后形成的噬菌斑就会从原来的混浊变为清亮；还有些载体分子携带外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的颜色有明显变化，如蓝色变为无色；有些λ噬菌体能侵染甲菌而不能侵染乙菌，携带外源DNA片段后便能侵染乙菌，
分子克隆常用技术
一、核酸的纯化 在分子克隆的所有操作中，最基本的操作是核酸的纯化。其关键步骤是去蛋白质，通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。每当需要把克隆有某一些所用的酶灭活或去除以便进行下一步时，可进行这种抽提。然而，如要从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化核酸，则要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后
分子克隆常用载体
分子克隆常用载体 DNA片段的克隆需要合适的载体，载体或是质粒，或是噬菌体，或是病毒，通常大多经过人工改造[地的。作为载体必须具备两条件：一是该载体在细胞内必须能自主复制，即必须具备复制原点；二是该载体必须具备适合的酶切位点，且这些酶切位点不在复制原点区域内。以上两条，保证了载体的可繁殖性和可利用
单克隆抗体的融合过程介绍
1．试剂与材料(1)供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。(2)1640培养液100ml。(3)完全1640液100ml。(4)2.5%FCS－1640液50ml。(5)HAT培养液100ml。(6)50%PEG：取分子量4000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前
单克隆抗体技术：细胞融合
实验概要本文介绍了单克隆抗体技术——细胞融合实验的操作流程。实验原理细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。 聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1 000时，呈乳
单克隆抗体细胞融合
单克隆抗体细胞融合（一）融合剂 细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1 000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机
单克隆抗体技术：细胞融合
实验概要本文介绍了单克隆抗体技术——细胞融合实验的操作流程。实验原理细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。 聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1 000时，呈乳
单克隆抗体技术：细胞融合
融合剂 细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。 聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1 000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与
单克隆抗体的细胞融合
融合剂 细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如灭活的仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定