分子克隆蛋白表达实验指南(十)
13.连接产物转化DH5α(预开42C水浴) 与T载体转化相同,先转化DH5α,筛选及扩增目的重组质粒 转化DH5α后挑6~8个菌落验证,验证项目: 1. 目的基因引物PCR验证 2. 表达载体引物PCR验证 3. Step2中PCR产物胶回收后,以胶回收为模板、基因引物进行nest PCR 4. 小抽双酶切验证 验证后再小量抽提质粒,保存50ul质粒及相应的DH5α细菌 小抽重组质粒转化表达菌BL21。转化BL21后只需基因引物PCR验证 目的基因表达 14.快速诱导表达 ......阅读全文
分子克隆蛋白表达实验指南(十)
13.连接产物转化DH5α(预开42C水浴) 与T载体转化相同,先转化DH5α,筛选及扩增目的重组质粒 转化DH5α后挑6~8个菌落验证,验证项目: 1. 目的基因引物PCR验证 2. 表达载体引物PCR验证 3. Step2中PCR产物胶回收后,以胶回收为模板、
分子克隆蛋白表达实验指南(十二)
– Note: The yield of fusion protein can be estimated by measuring the absorbance at 280 nm. The GST affinity tag can be approximated by 1 A280 Å 0.5
分子克隆蛋白表达实验指南(四)
7. PCR产物与TA载体连接 pGEM-T vector is T-tailed at the insert site. To improve the ligation efficiency, it is recommended PCR product be A-tailed. +A s
分子克隆蛋白表达实验指南(十三)
7. 电泳结束后,按比例从胶上割下相应约1cm条带(当按比例的条带割下后可相应的向两边再割一点,但是电透析时中间和两边的胶必须分开透析),用镊子或尺子将胶碾碎成2mm见方的小块。 8. 将碎块小心加入电透析tube中,200V,120~150min。 9. 移出放电透析tube的架子,
分子克隆蛋白表达实验指南(十九)
Desired pH Volume of 1M K2HPO4 (mL)Volume of 1M KH2PO4 (mL) 5.8 8.591.5 6.0 13.286.8 6.2 19.280.8
分子克隆蛋白表达实验指南(十七)
Buffers for His purification in denatured conditions: 配制时加终体积50%的水,之后定容至所需体积。先配pH 8.0的buffer(调pH需要较多NaOH),再统一配bufferC,D,E,分别调pH Buffer B (200ml
分子克隆蛋白表达实验指南(十六)
Amp(50mg/ml) 溶解1g Amp于足量的水中,最后定容至20ml。分装成小份于-20℃贮存。常以20~50ug/ml的终浓度添加于生长培养基,1:1000比例稀释 Kan(50mg/ml) 溶解1g Kan于足量的水中,最后定容至20ml
分子克隆蛋白表达实验指南(十五)
LB固体培养基 Tryptone 1g Yeast Extract 0.5g NaCl 1g Agar 1.5g 加蒸馏水至总体
分子克隆蛋白表达实验指南(六)
10. 测序 突变后氨基酸序列没有变化仍可用于表达。测序报告中blast时若有‘-’符号,则人工对照测序图谱。 测序验证后没有突变或者同义突变的重组质粒必须小抽,50ul,conc300ug/ml备份。测序文件应妥善保存,蛋白表达完成后一并提交存档。 获得GS后,即可构建含GE的重组T载体,用
分子克隆蛋白表达实验指南(三)
若有非特异性条带,可进行Touchdown PCR,提高引物的特异性。 PCR反应条件: 1 94C 5min 2 94C 45s 3 65C 45s 退火温度视
分子克隆蛋白表达实验指南(十一)
SDS-PAGE胶样品排列: MarkerUII 37CUI’I’ Marker:低分子量蛋白marker,上样10ul UI:未诱导菌液,上样10ul。任取37C和20C中一个 I:诱导后对照,上样10ul UI’, I’代表G
分子克隆蛋白表达实验指南(十八)
15%胶 水1.11.872.33.43.854.65.76.99.211.5 30%聚丙烯酰胺混合液2.54.2557.58.751012.5152025 1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.
分子克隆蛋白表达实验指南(二)
取DEPC水时切记带上手套 Genequant使用方法: 开机-set-up-enter(只更改DNA/RNA,看光波是否为320nm)-set-ref(此时插入空白对照)-样品 1.使用前将比色皿中水吸出,用1ml蒸馏水重新洗涤再将比色皿中的水吸尽(先用1ml枪吸,后用100ul枪吸)
分子克隆蛋白表达实验指南(七)
目的基因表达 14.快速诱导表达 快速诱导目的是为检测该重组质粒在BL21中是否能被诱导表达重组蛋白,并确定在不同IPTG浓度蛋白诱导效率的差异。 5. 挑单克隆菌落于7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml培养管中,37C振荡培养过夜(8-16h)。 6. 37C,1mM
分子克隆蛋白表达实验指南(十四)
RbCl制备感受态细胞 需准备的灭菌器具和培养液: SOB,Buffer 1,Buffer 2,3×200ml广口瓶,1.5ml EP管,1×500ml离心瓶(按200ml摇菌量计算),2×50ml离心管,2×移液管(用于加Buffer 1),液氮,冰 离心管,EP管,移液管使用前均需要放
分子克隆蛋白表达实验指南(五)
8. TA质粒转化菌落的验证 与表达载体的验证不同,转化TA质粒时不用双酶切验证。只需用目的基因引物和TA载体引物PCR验证即可。TA载体引物PCR片段比插入片段大约长150bp。 目的基因退火温度与之前胶回收时温度相同,TA退火温度60C即可,但可在55~70之间变动,不会影响结果。 挑取至
分子克隆蛋白表达实验指南(一)
目的基因克隆包括保存用全长基因(gene for saving, GS)和表达用全长基因(gene for expression, GE)两部分。 这两部分所克隆的基因都是全长片段,但克隆的策略及目的不同。直接用精确克隆(及引物从基因CDS两端开始)很难找到高效价的引物,且cDNA中目的基
分子克隆蛋白表达实验指南(九)
SDS-PAGE胶样品排列: MUIBS1S1P1BS2S2P2UIT1T2T3T4 M:marker;上样10ul UI:未诱导对照;10ul BS:超声前样品;10ul S:超声后上清; 10ul P:超声后沉淀; 10ul T:诱导后每隔1h样品,1
分子克隆蛋白表达实验指南(八)
15. 小量蛋白诱导表达 该步骤的目的是检测蛋白是否在上清存在表达。低温时蛋白易于表达于上清,因此小量蛋白诱导表达以20或30C为培养温度。 1. 挑一单克隆的菌落于5ml含有相应的抗生素的LB培养液中,37℃振荡培养过夜(8-16h)。 2. 过夜培养液加入三瓶50ml含
分子克隆实验指南第四版发售
在生命科学领域,没有一本书比它更红,几乎每个实验室都有,几乎每个人都翻过。它就是《分子克隆实验指南》。30年前,这本书诞生于冷泉港实验室出版社,它的前身是1980年冷泉港真核基因分子克隆讲习班实验方案的汇编。7年后,该书又出了第二版。当时的人们也许未曾料到,这部著作在20年的时间里竟成为指导生命
有关融合蛋白表达载体的克隆
在构建融含蛋白表达载体时除了要注意插入片段的方向、读码框架与载体保持一致外,注意以下问题可能会减少一些不必要的麻烦,当外源片的插入载体起始密码的后面,另一个基因的前面时,注意检查插入后基因的两端是否引入了新的终止密码,特别是用到Klenow mung bean 核酸酶,T4 Polymerase
表达蛋白检测实验
免疫印迹法 免疫沉淀法 点印迹法 实验方法原理 当重组病毒通过噬斑纯化和扩增后,免疫印迹可用于鉴定重组蛋白,并检测其是否有预期的大小以及是
表达蛋白检测实验
实验方法原理 当重组病毒通过噬斑纯化和扩增后,免疫印迹可用于鉴定重组蛋白,并检测其是否有预期的大小以及是否从感染细胞中分泌。下面的步骤是介绍检测非分泌性(细胞内)蛋白的,如果重组蛋白是分泌到培养基中的,可按注解中的步骤操作。实验材料 生长至汇片的单层 BS-C-1 细胞重组痘苗病毒储液试剂、试剂盒
分子克隆实验载体DNA的选择
①质粒:质粒是细菌染色体外遗传因子,DNA呈环状,大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在,很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态,一是“紧密型”;二是“松弛型”。此外还应具有分子量小,易转化,有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的
差异表达-cDNA-的重新扩增、克隆与测序实验
试剂、试剂盒 琼脂糖凝胶蒸馏水 DNA 点样染料甘油蒸馏水 溴酚蓝 二甲苯腈 FF溴化乙锭溶液任意引物(H-AP)cDNAdNTP 混合液未标记的锚定引物载体特异性引物PCR 缓冲液Tris-HClKClMgCl2明胶 TaqDNA 聚合酶仪器、耗材 电泳装置离心管热循环仪薄壁 PCR 管UV 透射
差异表达-cDNA-的重新扩增、克隆与测序实验
试剂、试剂盒 琼脂糖凝胶 蒸馏水 DNA 点样染料 甘油 蒸馏水 溴酚蓝 二甲苯腈 FF 溴化乙锭
差异表达-cDNA-的重新扩增、克隆与测序实验
从丙烯酰胺凝胶上切下潜在的差异表达 cDNA 之后,用同一种锚定-任意引物组合重新扩增 cDNA, 反应条件与最初 PCR 相同。重新扩增的产物,可以进行克隆和测序,以供进一步分析。本实验来源于 PCR 实验指南(第二版),作者:种康,瞿礼嘉。试剂、试剂盒琼脂糖凝胶蒸馏水DNA 点样染料甘油蒸馏水溴
克隆技术(十)
克隆多利羊1996年7月5日克隆出一只基因结构与供体完全相同的小羊“多利”(Dolly),世界舆论为之哗然。“多利”的特别之处在于它的生命的诞生没有精子的参与。研究人员先将一个绵羊卵细胞中的遗传物质吸出去,使其变成空壳,然后从一只6岁的母羊身上取出一个乳腺细胞,将其中的遗传物质注入卵细胞空壳中。这克
分子克隆介绍
各位小伙伴,大家还记得当初进实验室的时候接触到的一个实验技能是什么呢?没错,是 PCR 扩增。小编曾经也是,看着自己亲自配比 PCR 克隆扩增的每个组分,亲眼看着琼脂糖凝胶在紫外透光台上发出的幽绿色的荧光,也是深深被迷住。但总不可能成天就对着这个邪魅的荧光发呆,对吧?看久了,她会爱上你的眼
蛋白质的短暂表达实验
基本方案 实验材料 载体 试剂、试剂盒