分子克隆蛋白表达实验指南(十二)
– Note: The yield of fusion protein can be estimated by measuring the absorbance at 280 nm. The GST affinity tag can be approximated by 1 A280 Å 0.5 mg/ml. (This is based on the extinction coefficient of the GST monomer using a Bradford protein assay. Other protein determination methods may result in different extinction coefficients.). – ......阅读全文
分子克隆-蛋白表达实验指南(十二)
– Note: The yield of fusion protein can be estimated by measuring the absorbance at 280 nm. The GST affinity tag can be approximated by 1 A280 Å 0.5
分子克隆-蛋白表达实验指南(十八)
15%胶 水1.11.872.33.43.854.65.76.99.211.5 30%聚丙烯酰胺混合液2.54.2557.58.751012.5152025 1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.
分子克隆-蛋白表达实验指南(三)
若有非特异性条带,可进行Touchdown PCR,提高引物的特异性。 PCR反应条件: 1 94C 5min 2 94C 45s 3 65C 45s 退火温度视
分子克隆-蛋白表达实验指南(四)
7. PCR产物与TA载体连接 pGEM-T vector is T-tailed at the insert site. To improve the ligation efficiency, it is recommended PCR product be A-tailed. +A s
分子克隆-蛋白表达实验指南(十三)
7. 电泳结束后,按比例从胶上割下相应约1cm条带(当按比例的条带割下后可相应的向两边再割一点,但是电透析时中间和两边的胶必须分开透析),用镊子或尺子将胶碾碎成2mm见方的小块。 8. 将碎块小心加入电透析tube中,200V,120~150min。 9. 移出放电透析tube的架子,
分子克隆-蛋白表达实验指南(十)
13.连接产物转化DH5α(预开42C水浴) 与T载体转化相同,先转化DH5α,筛选及扩增目的重组质粒 转化DH5α后挑6~8个菌落验证,验证项目: 1. 目的基因引物PCR验证 2. 表达载体引物PCR验证 3. Step2中PCR产物胶回收后,以胶回收为模板、
分子克隆-蛋白表达实验指南(二)
取DEPC水时切记带上手套 Genequant使用方法: 开机-set-up-enter(只更改DNA/RNA,看光波是否为320nm)-set-ref(此时插入空白对照)-样品 1.使用前将比色皿中水吸出,用1ml蒸馏水重新洗涤再将比色皿中的水吸尽(先用1ml枪吸,后用100ul枪吸)
分子克隆-蛋白表达实验指南(十四)
RbCl制备感受态细胞 需准备的灭菌器具和培养液: SOB,Buffer 1,Buffer 2,3×200ml广口瓶,1.5ml EP管,1×500ml离心瓶(按200ml摇菌量计算),2×50ml离心管,2×移液管(用于加Buffer 1),液氮,冰 离心管,EP管,移液管使用前均需要放
分子克隆-蛋白表达实验指南(五)
8. TA质粒转化菌落的验证 与表达载体的验证不同,转化TA质粒时不用双酶切验证。只需用目的基因引物和TA载体引物PCR验证即可。TA载体引物PCR片段比插入片段大约长150bp。 目的基因退火温度与之前胶回收时温度相同,TA退火温度60C即可,但可在55~70之间变动,不会影响结果。 挑取至
分子克隆-蛋白表达实验指南(十五)
LB固体培养基 Tryptone 1g Yeast Extract 0.5g NaCl 1g Agar 1.5g 加蒸馏水至总体