基于钙调素与荧光蛋白融合的钙指示剂实验
实验材料 PRSETB 细菌表达质粒HeLa 细胞株试剂、试剂盒 苯甲基横酰基氟化物EGTA 缓冲液氯化钙缓冲液仪器、耗材 超声发生器荧光光谱仪实验步骤 本文中描述的方法涵盖了变色子在细菌及真核细胞里的克隆与表达（见 4.3.1 )，变色子的生物化学和生物物理特征鉴定（见 4.3.2 )，以及通过 FRET 技术将变色子用于体内 Ca2+ 成像（见 4.3.3 )。3.1 变色子的克隆使用 5 个不同的部件：CFP、YFP、N-CaM、C-CaM 和 CRS，用标准的重组 DNA 方法 [8] 模块式组装钙变色子。 CFP 和 YFP 质粒可从 Clontech 购得；CaM 来自 Dr. Ikum；CRS 用寡核苷酸链反应合成。为制取钙变色子的 DNA 操控不在这里详细讲述，因为没有适合所有可能性的单一技术（见注 4)。钙变色子制成之后，融合片段克隆到 PRSETB 质粒中，......阅读全文
基于钙调素与荧光蛋白融合的钙指示剂实验
钙调素（CaM) 是普遍分布的蛋白质，参与钙介入的信号转导。当 Ca2+ 流入时，CaM 获得强亲和力，结合各种带有一个或多个CaM 识别序列的胞内蛋白，启动或终止 Ca2+ 调控的信号串联。本实验来源「现代蛋白质工程实验指南」〔德〕K.M.阿恩特、K.M.米勒编著。实验材料PRSETB 细菌表达质
基于钙调素与荧光蛋白融合的钙指示剂实验
基于钙调素与荧光蛋白融合的钙指示剂 实验材料 PRSETB 细菌表达质粒 HeLa 细胞株
基于钙调素与荧光蛋白融合的钙指示剂实验
实验材料 PRSETB 细菌表达质粒HeLa 细胞株试剂、试剂盒 苯甲基横酰基氟化物EGTA 缓冲液氯化钙缓冲液仪器、耗材 超声发生器荧光光谱仪实验步骤 本文中描述的方法涵盖了变色子在细菌及真核细胞里的克隆与表达（见 4.3.1 )，变色子的生物化学和生物物理特征鉴定（见 4.3.2 )，以及通过
绿色荧光蛋白融合抗体研究
融合抗体 近二十年来，抗体生成技术有了飞速发展，已经从细胞工程抗体（杂交瘤技术一单克隆抗体）发展到了第三代抗体：基因工程抗体，尤其是噬菌体抗体库技术的出现，解决了人源抗体的研制问题，促进了各种性能优良抗体以及具有多种功能的抗体融合蛋白的开发。单链抗体（Single-chain variable
融合蛋白的酶解实验
基本方案 辅助方案 备选方案1 辅助方案 备选方案2 备选方案3 实验材料 融合蛋白
融合蛋白的酶解实验
实验材料 融合蛋白试剂、试剂盒 SDS仪器、耗材 水浴锅培养箱离心机实验步骤 1. 准备两个小量预试验反应以确定最佳温育时间： （1）反应1：20 μl 含有1 μl 200 μg/ml Xa因子的1 mg/ml 融合蛋白，室温下反应（2）反应2：5 μl 不含因子Xa的1 mg/ml 融合蛋白（
GST－融合蛋白沉降实验
实验材料 细胞裂解液其中蛋白质 35S 用标记试剂、试剂盒 裂解缓冲液SDS 聚丙烯酰胺凝胶探针GST 蛋白仪器、耗材 沸水浴翻转祥品旋转仪谷胱甘肽琼脂糖球珠实验步骤 材料缓冲液和溶液将缓冲液稀释到适当浓度。裂解缓冲液20 mmol/LTris-Cl(pH8.0)200 mml/L NaCl1 mm
GST－融合蛋白沉降实验
GST 沉降实验与 far western(方案 2) 相比有—个优点：探针蛋白是在更自然的环境下与可能的搭档蛋白孵育，因而增强了相互作用的有效性。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。实验材料细胞裂解液其中蛋白质 35S 用标记试剂、试剂盒裂解
GST－融合蛋白沉降实验
实验材料 细胞裂解液 其中蛋白质 35S 用标记 试剂、试剂盒 裂解缓冲液 SDS 聚丙烯酰胺凝胶
流式细胞计量术（基于荧光的蛋白质分析）实验
活细胞表面抗原的荧光染色（直接免疫荧光） 活细胞表面抗原的荧光染色（间接免疫荧光） 实验材料 细胞
流式细胞计量术（基于荧光的蛋白质分析）实验
活细胞表面抗原的荧光染色（直接免疫荧光）实验材料细胞初始抗体试剂、试剂盒PBS 溶液叠氮化钠实验步骤1. 在培养皿中加入 1 mmol/L EDTA/1 mmol/L EGTA 的 PBS 溶液，轻摇，收获细胞。4℃ 1000 g 离心 5 分钟。2. 用 4 ml PBS+0.1% 叠氮化钠和 1
流式细胞计量术（基于荧光的蛋白质分析）实验
活细胞表面抗原的荧光染色（直接免疫荧光） 活细胞表面抗原的荧光染色（间接免疫荧光） 实验材料 细胞
LSCM绿色荧光融合蛋白表达载体的构建
绿色荧光融合蛋白表达载体的构建 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP) 及其突变体能在各种不同的生物系统中表达，这对细胞生物学的研究具有重要意义。而荧光蛋白的折叠能力及其同细胞内蛋白的融合能力，使研究 者能直接在细胞体内观察到蛋白质的特性。研究者不需要把蛋白质经过
GST融合蛋白表达与纯化的实验步骤与注意事项（一）
GST表达融合蛋白 pGEX-KG大小：5006bp，氨苄青霉素抗性(Ampr)，IPTG诱导表达酶切位点：BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、HindIII 994GST分子量：构建pG
GST融合蛋白表达与纯化的实验步骤与注意事项（二）
7、转化BL21(DE3)pLysS菌株检测GST融合蛋白的表达(1)冰上融化BL21(DE3)pLysS感受态细胞(天根)(2)2 ml离心管中，加入25μl BL21+ 3μl质粒(300-500ng)，混匀(质粒≤感受态1/10)(3)冰上放置30min(4)42°C，90s(5)冰上放置2-
融合蛋白的酶解实验4
实验材料融合蛋白试剂、试剂盒SDS盐酸胍CaCl2仪器、耗材水浴锅培养箱离心机实验步骤1. 将融合蛋白在≥10倍体积的20 mmol/l Tris·Cl（pH7.4）/6 mol/l 盐酸胍中透析4 h，或将盐酸胍加入融合蛋白中至终浓度为6 mol/l。2. 将样品在100倍体积的20 mmol
融合蛋白的免疫筛选实验
实验材料 大肠杆菌试剂、试剂盒 LB顶层琼脂糖叠氮钠第一抗体仪器、耗材 硝酸纤维素滤膜实验步骤 1. 在150 ml LB 平板上滴定λgt11 cDNA文库的滴度，宿主菌为大肠杆菌LE392菌株，每个平板使用7 ml 1%LB顶层琼脂。2. 选择适当的滴度铺平板，于37℃温育8 h。 3.
融合蛋白的酶解实验2
实验材料融合蛋白试剂、试剂盒SDS盐酸胍CaCl2仪器、耗材水浴锅培养箱离心机实验步骤1. 将融合蛋白在≥10倍体积的20 mmol/l Tris·Cl（pH7.4）/6 mol/l 盐酸胍中透析4 h，或将盐酸胍加入融合蛋白中至终浓度为6 mol/l。2. 将样品在100倍体积的20 mmol
融合蛋白的免疫筛选实验
基本方案 IPTG法 实验材料 大肠杆菌 试剂、试剂盒
融合蛋白的酶解实验3
实验材料融合蛋白试剂、试剂盒SDS钠盐凝血酶裂解液凝血酶仪器、耗材水浴锅培养箱离心机实验步骤1. 准备两个小量预试验以确定最佳裂解反应条件： （1）反应1：20 μl 1 mg/ml 融合蛋白溶液（在合适的缓冲液中）及0.2 μg 凝血酶。（2）反应2：5 μl 1 mg/ml 融合蛋白溶液（模拟
融合蛋白的酶解实验6
实验材料融合蛋白试剂、试剂盒SDSCaCl2重组牛肠激酶仪器、耗材水浴锅培养箱离心机实验步骤1. 做预试验监测肠激酶与融合蛋白按不同比例混合后的裂解效率，准备5个反应体系： （1）反应1至4：20 μl 融合蛋白；0.2 U、0.5 U、1 U和2 U的rEK，加50 mmol/l Tris·Cl
融合蛋白的酶解实验5
实验材料融合蛋白试剂、试剂盒SDSGST清洗缓冲液GST洗脱缓冲液仪器、耗材水浴锅培养箱离心机实验步骤1. 在20或50 ml 带球旋盖的试管中，用20倍体积含1%Triton X-100的PBS液洗涤结合在谷胱甘肽-琼脂糖珠的GST融合蛋白。室温下，在台式离心机上以500 g 离心10 s 沉淀
融合蛋白的酶解实验1
实验材料融合蛋白试剂、试剂盒SDS仪器、耗材水浴锅培养箱离心机实验步骤1. 准备两个小量预试验反应以确定最佳温育时间： （1）反应1：20 μl 含有1 μl 200 μg/ml Xa因子的1 mg/ml 融合蛋白，室温下反应（2）反应2：5 μl 不含因子Xa的1 mg/ml 融合蛋白（模拟消化
GST融合蛋白的亲和纯化实验
实验方法原理 琼脂糖颗粒和诱饵蛋白复合体在洗涤时并不会损失而且所有反应都含有等量的诱饵蛋白。为了证明在洗涤期间没有任何材料损失，应使用 1/10 的 GST 融合体加样做平行 SDS-PAGE 凝胶电泳并染色以便更确切地比较 GST 融合体蛋白带。另外，融合蛋白的降解可能导致诱饵蛋白的量减少
GST融合蛋白的亲和纯化实验
GST 共结合纯化法 实验方法原理 琼脂糖颗粒和诱饵蛋白复合体在洗涤时并不会损失而且所有反应都含有等量的诱饵蛋白。为了证明在洗涤期间没有任何材料损失，应使用
GST融合蛋白的亲和纯化实验
实验方法原理琼脂糖颗粒和诱饵蛋白复合体在洗涤时并不会损失而且所有反应都含有等量的诱饵蛋白。为了证明在洗涤期间没有任何材料损失，应使用 1/10 的 GST 融合体加样做平行 SDS-PAGE 凝胶电泳并染色以便更确切地比较 GST 融合体蛋白带。另外，融合蛋白的降解可能导致诱饵蛋白的量减少，尤其是当
流式细胞计量术（基于荧光的蛋白质分析）实验2
活细胞表面抗原的荧光染色（间接免疫荧光）实验材料细胞试剂、试剂盒PBS 溶液叠氮化钠实验步骤1. 在培养皿中加入 1 mmol/L EDTA/1 mmol/L EGTA 的 PBS 溶液，收获细胞。此程序比通常的胰蛋白酶消化时间长。4℃ 1000 g 离心 5 分钟。操作始终在冰上进行。2. 用 4
基因置换实验——构建融合蛋白
实验材料菌株BY4741质粒PDB118试剂、试剂盒磷酸盐缓冲液仪器、耗材YPD 平板YPD 液体培养基血球计数板SC-his平板实验步骤YPD 平板 第 1 天将菌株 7-3 在 YPD 平板上划单克隆，30°C 下培养两天。第 3 天挑取单克隆，在 5 mlYPD 液体培养基中培养，30°C 过
董梦秋等钙离子／钙调素依赖性蛋白激酶II调控机制获进展
2013年6月25日，北京生命科学研究董梦秋实验室在《eLIFE》杂志发表题为“CAMKII and Calcineurin regulate the lifespan of Caenorhabditis elegans through the FOXO transcription fact
钙钙调素对白杄花粉萌发和花粉管生长的调节
实验概要本实验以白杄花粉为实验材料，用不同浓度钙调素拮抗剂TFP及外施钙调素处理培养的花粉，结合荧光标记和免疫抗体标记技术分析游离钙离子和钙调素在花粉管中的定位，探讨钙-钙调素信使系统在花粉萌发和花粉管生长过程中的生理作用。主要试剂1. Ca2(NO)3和硼酸：以双蒸水溶解，配制成100×