哺乳动物细胞的RNAi技术策略(3)
5. si 表达框架si 表达框架(si expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的si 表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这个方法最早是由Castanotto和其同事(5)采用，包括一个 pol III启动子，一段发夹结构si ，一个 pol III终止位点。和si 表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。因此，SECs成为筛选si 的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和si 的最适搭配！如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的si 后，可以直接克隆到载体中构建si 表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达si 和长效抑制的研究。这个方法的主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话，那问题就可以解决了。另外，没......阅读全文
哺乳动物细胞的RNAi技术策略(3)
5. si 表达框架si 表达框架(si expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的si 表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这个方法最早是由Castanotto和其同事(5)采用，包括一个 pol III启动子，一段发夹结构si ，一个
哺乳动物细胞的RNAi技术策略(1)
目前RNAi技术已经进入了生物科学研究的许多领域，成为了一种主要的生物学研究工具，发展得相当迅速，并受到了此次诺贝尔奖评审委员会的青睐，获得2006年诺贝尔奖医学/生理奖。然而这一才历经十个年头的技术依然对于许多研究人员来说还是很陌生的，以下是有关 i技术在哺乳动物细胞中应用的具体设计策略，主要
哺乳动物细胞的RNAi技术策略(2)
1.化学合成尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的――研究人员几乎不需要做什么工作。包括Ambion和Qiagen公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成si 。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3―4对si s 的成本就更高了，
哺乳动物RNAi技术－Mammalian－RNA－Interference
Mammalian RNA InterferenceThomas TuschlLaboratory for RNA Molecular BiologyThe Rockefeller University, New York Excerpted from RNAi: A Guide To Gene S
哺乳动物RNAi技术全面实验方法
WHENVIRUSESINFECTEUKARYOTICCELLSdomly integrate into host genomes, double-stranded RNA (dsRNA) is frequently produced from the invading genes, either
脊髓动物细胞中特殊的RNAi现象
1 .由长dsRNA引起的非特异性基因沉默寻找哺乳动物细胞中存在RNAi的证据颇费了一番周折。将较长的dsRNA（超过30个碱基对）转染几种特定脊髓动物细胞系统如小鼠的早期胚胎中，斑马鱼和中华仓鼠卵巢细胞中，能够诱发细胞内的RNAi现象，而在大部分脊髓动物的成体细胞中不存在类似于RNAi的机制，却引
哺乳动物细胞的生物特征
哺乳动物是全身被毛,运动快速,恒温,胎生和哺乳的脊椎动物.它是脊椎动物中躯体结构,功能和行为最复杂的一个高等动物类群.鸟类和哺乳类都是从爬行动物起源的,它们分别以不同的方式适应陆栖生活所遇到的许多基本矛盾(陆地上快速运动,防止体内水分蒸发,完善的神经系统和繁殖方式),并在新陈代谢水平全面提高的基
动物细胞大规模培养技术3
五、动物细胞无血清培养技术 动物细胞无血清培养是生物科学领域中的重要研究课题之一。由于无血清培养基可以是完全采用已知分子结构和构型组分的低蛋白或无蛋白培养基。因而它不仅为研究和阐明细胞生长、增殖和分化的调节机制提供了有力的工具，而且为现代生物技术，尤其是细胞工程的应用准备了更好的条件。下面就动物细
RNAi的实验原理和操作实用技术(3)
3.DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。4.机械法转染技术也包括使用机械的方法，
RNAi技术
DNA芯片检测siRNA专一性 长片断的双链RNA (dsRNA) 导入例如植物，真菌，果蝇，线虫等生物的细胞中会引发同源mRNA的降解——这就是所谓的RNA interference (RNAi)。RNAi分两个步骤，首先是长片断双链dsRNAs被核酶Dicer切割成21—25个碱基的sm
哺乳动物细胞的细胞培养
实验室设计 细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒
哺乳动物细胞总RNA的分离
哺乳动物细胞总ＲＮＡ的分离细胞的裂解提取步骤注意事项 这一从培养的单层哺乳动物细胞中分离RNA的实验程序系为Favaloro 等（1980）所介绍程序的改良。该程序同样适用于从悬浮培养的哺乳动物细胞中或从易于分散成单个细胞的哺乳动物组织中分离RNA。但不适用于从固体组织中提取RNA，因为用这种裂解
哺乳动物细胞总RNA的分离
实验概要本实验介绍了从培养的单层哺乳动物细胞中分离RNA的实验程序，该程序同样适用于从悬浮培养的哺乳动物细胞中或从易于分散成单个细胞的哺乳动物组织中分离RNA。但不适用于从固体组织中提取RNA，因为用这种裂解细胞的方法（在SDS存在的条件下用蛋白酶K消化)去消化组织速度很慢，导致内源性RNA酶在被蛋
RNAi技术的应用
5 RNAi技术的应用5.1 功能基因组和遗传学应用随着各种模式生物和人类基因组测序的完成，基因功能的研究远远落后于大量序列所提供的信息，研究和发现基因功能成为越来越紧迫的任务。长期以来，破坏基因结构或抑制基因表达是研究基因功能的重要方法，如常用的基因敲除技术( gene knock out) 。基
哺乳动物细胞胞质RNA的分离
试剂、试剂盒 冰冷的磷酸盐缓冲液 NaClKCl Na2HP04•7H20 KH2PO4 冰冷的裂解缓冲液： LTris-HCl NaCl MgCL2 NkmidetP-40 胎盘 RNase 抑制剂 SDS 蛋白酶 K 酚 氯 仿 异戊醇 乙酸钠 (DEPC 处理） 无水乙醇 乙醇 乙酸钠
哺乳动物细胞的简介和生物特征
哺乳动物细胞（mammalian cell)来自哺乳动物体的细胞。它的培养由于可用来大量生产疫苗、重组蛋白和其他医疗产品而倍受重视。已建成许多重要的细胞系，这些细胞来自鼠、人、猴等。 哺乳动物是全身被毛,运动快速,恒温,胎生和哺乳的脊椎动物.它是脊椎动物中躯体结构,功能和行为最复杂的一个高等动
哺乳动物细胞基因稳定转染的实验
基本方案 实验材料 哺乳动物细胞 试剂、试剂盒
哺乳动物细胞基因稳定转染的实验
分析基因的功能常需要形成含有稳定整合了该基因的哺乳动物细胞系。在转染中大约有1/104细胞将稳定整合外源因而可用一显性（正向）选择标记来分离稳定的转化细胞。用可高效转染的细胞系来确保转染成功。另外，应包括合适的对照以确定目的基因无细胞毒性。实验材料哺乳动物细胞试剂、试剂盒完全培养液仪器、耗材培养箱离
哺乳动物细胞胞质RNA的分离
试剂、试剂盒 冰冷的磷酸盐缓冲液 NaCl KCl Na2HP04•7H20 KH2PO4 冰冷的裂解缓冲液： LTris-HCl
哺乳动物细胞的细胞培养温度
维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定而适宜的温度；不同种类的细胞对培养温度要求也不同。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能
哺乳动物细胞基因稳定转染的实验
实验材料 哺乳动物细胞试剂、试剂盒 完全培养液仪器、耗材 培养箱离心管实验步骤 1. 确定所要转染的细抱系能呈独立集落生长。对于贴壁细胞，在10 cm 组织培养培养皿中接种约100个细胞，培养10~12天，毎4天换液1次。亚甲蓝染色后对成活的细胞集落进行计数。 2. 确定母代细胞的选择条件：将一
哺乳动物细胞基因突变试验
哺乳动物体外培养细胞的基因正向突变试验常用的测试系统有小鼠淋巴瘤L5178Y细胞，中国仓鼠肺V79细胞和卵巢CHO细胞的三个基因位点的突变，即次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、胸苷激酶(TK)及Na+／K+ATP酶(OUA)位点。HGRPT和Na+/K+ATP酶位点突变可用于上述三种细胞，O
哺乳动物细胞总RNA快速分离
试剂、试剂盒 尤钙镁离子磷酸缓冲盐溶液 EDTASDS 乙酸钠水平衡的苯酚 乙醇 Tris-Cl NaCL实验步骤 一 材料与设备1)尤钙镁离子磷酸缓冲盐溶液 (PBS) 2)10 mmol/L EDTA (pH8.0 ) 3)0.5% SDS 4)0. l mol/L 乙酸钠（p
哺乳动物细胞总RNA快速分离
试剂、试剂盒 尤钙镁离子磷酸缓冲盐溶液 EDTA SDS 乙酸钠 水平衡的苯酚 乙醇 Tris-Cl NaCL
培养两栖动物细胞与哺乳动物细胞区别
1.培养两栖动物细胞与哺乳动物细胞区别在培养液上,也就是血浆的不同,其它的一样；2.培养两栖动物体细胞比哺乳动物细胞难养,原因在于两栖动物个体都较小,血浆制备较难；3.原代培养的话,两栖动物细胞用两栖动物的血浆,哺乳动物细胞用哺乳动物的血浆,（同物种个体上取下的血浆,最好自体上取下的）和其它营养物质
哺乳动物细胞实验室的构建方案
一、实验室设计细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，为10万级洁净
哺乳动物细胞实验室的构建方案
一、实验室设计 细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，为10万
2.1.3－哺乳动物细胞胞质RNA的分离
下述方法是纯化组织培养细胞胞质 RNA 的 简便并行之冇效的方法 ，此方法出现在 RNA 分离的较早阶段，主要步骤即离心去除细胞核试剂、试剂盒冰冷的磷酸盐缓冲液NaClKClNa2HP04•7H20KH2PO4冰冷的裂解缓冲液： LTris-HClNaClMgCL2NkmidetP-40胎盘RNas
实用哺乳动物细胞培养手册（中）
细胞培养环境1、实验室设计 细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受 其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响， 要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌 操作区设在室内较少走动的内侧，常规
实用哺乳动物细胞培养手册（下）
细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒 清洗 在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。微生物产品附带杂物，上次细胞残留物及非营养成分的化学物质，均能影响培养细胞的生长。因此对新使用玻璃器 皿和重新使用的培养器皿都要严格彻底的清洗，且要根据器皿的组成材料不同，选择不同 的清