怎么检测设计的引物是否合适
可以用于正式实验的引物必须满足以下条件：a溶解曲线单峰，窄而尖，否则可能有非特异性扩增；峰的位置横坐标一般在80度以上，这个温度为PCR产物的解链温度，如果在75度附近，可能是引物二聚体，miRNA染料法检测时，溶解曲线的峰的位置可能在75度附件b琼脂糖电泳为明亮的一条带，条带一般在100bp以上，如果设计引物时PCR产物在100bp一下，需要仔细辨认是否为引物二聚体；引物二聚体的条带一般在50bp左右，条带弥散，暗。c扩增曲线呈“S”形，一般情况下，S形越陡，扩增效率越高，S形越平，扩增效率低。有时会出现扩增曲线只有线性期，没有指数期的情况，这时一般扩增效率较低，建议检测一下扩增效率，用标准曲线法计算相对表达量。染料法的扩增曲线比探针法的扩增曲线要好看。d样品Ct值小于30，对于Ct大于30的情况，建议重新设计一对引物，重新调试。如果几对引物的Ct值都较大，可以适当放宽Ct至35。但是Ct值肯定不能大于35。......阅读全文
引物纯化的方法有哪些
如今，引物纯化方式多种多样。各位科研君，每天忙碌奔波于核酸提取、载体构建、蛋白表达等环节，没有深入了解过各种引物纯化方式吧！今天，小编带各位对各种引物纯化方式作下对比。各位科研君在以后的研究中，记得对号入座哦！ 一般纯化方式 目前，采用的主打的引物纯化方式是脱盐纯化。其只能纯化掉
什么是上下游引物
引物（Primer）在聚合作用的起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序列。在核酸化学中，引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反
概述合成cDNA引物的选择
1、随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA
定量PCR仪引物长度设定
① 引物长度 一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。 在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃ 在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-
最长可以合成多长的引物？
我们合成过100base的引物，但是产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过80base。引物越长，出现问题的概率就越大，按照目前的引物合成效率，大于80base的粗产品，全长引物的百分比不高，后续处理还有丢失很多，最后的产量很低。
PCR引物设计及评价实验
实验方法原理聚合梅链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法，故又称基因的体外扩增法。PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多，最广泛的手段之一，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环，使用不合适的PCR引物容易导致实
用什么溶解引物最合适？
常用的溶剂是水或者TE缓冲液（pH7.4——8.0），两者在实际实验中都是常用的。一般认为，TE缓冲液比较稳定，能提供稳定的pH环境，适合于保存引物（以及质粒或基因组DNA）。但也有人认为，TE中的EDTA分子会影响后续PCR的效率。如果您很注重PCR效率的话就要考虑到这一点。而双蒸水很易得，操作方
引物的Tm值是什么
负责引物合成的公司会给你引物的详细信息，其中有理论tm值，应该是和这个公式tm=2*（a+t）+4*(g+c)计算的一样，你在进行调整优化即可。
引物的TM值如何计算
Tm值就是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构在热变性过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系。核酸Tm值（解链温度）计算评价标准是核酸所吸收的光线量达到其所增加吸收260nm光线的量的两倍达到的温度，当核酸达到Tm值
如何计算引物的Tm值？
引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。 长度为25base以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为： Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+]
什么是上下游引物
引物（Primer）在聚合作用的起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序列。在核酸化学中，引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链
引物延伸分析（primer－extension－analysis）
引物延伸分析（primer extension analysis）主要用于mRNA 5′端作图。poly（A）+RNA首先与过量5′端标记的且与靶RNA互补的单链寡核苷酸引物杂交，然后用反转录酶延伸这个引物。产生的cDNA与RNA模板互补且长度与引物5′端和RNA 5′端之间的距离相等。该法在mR
PCR的引物设计注意要点
引物（primers)：引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。引物的重要性：在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏
拿到引物之后先做什么？
一般由公司合成好的引物，最终发货的都是干粉形式。由于干粉是很细微的干燥粉末，肉眼几乎不可见，同时又很容易飞扬起来。所以在接到引物管以后，切记不要急于打开管盖。而是要先保持盖住状态、把管子放到离心机里做短暂离心，使干粉收集到管底。然后才可开盖、进行下一步的溶解。
PCR实验技术指南(引物设计)
所谓“工欲善其事，必先利其器”，这年头手工设计引物的人似乎不多，还是用软件方便些，防止你一不小心看走眼，丢一个碱基，同时计算起来也方便。设计软件有很多，既可以在线设计(如Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)，
PCR技术要素引物设计原则
①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内
反向PCR引物设计的原理
可以这样来说吧，首先你应该有一条已知的序列，反向引物设计时在序列的5'方向找一段序列然后反向互补作为反向引物，在3'方向直接找一段序列作为正向引物。这样就OK了，这是引物的设计，至于其他条件可以参考相关文献.
合成的引物应如何保存？
没有溶解的引物非常稳定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀释为100 μmoL/L 的储存液，分装数份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反复多次冻融会降低使用寿命）。使用前，将浓溶液稀释成工作液（10 pmol/ml或20 pmol/ml）后进行实验。注意：工作液千万别用T
Primer－3－在线引物设计攻略
开始之前：其实非常简单，不需要你下载任何软件，但是你得有一台电脑能上网。当然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本次讨论范围。另外，要先对PCR目的序列的长度有个大致估计，好了，马上开始吧：第一步：找到Primer3的站点。 你不用记住这个站点，但是要记住“Prim
什么是上下游引物？
引物（Primer）在聚合作用的起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序列。在核酸化学中，引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反
如何测定引物的OD值？
用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2~0.8之间（吸光度太高或太低会有较大的误差）。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1 ml 并在1 ml 标准比色皿中测定其吸光度，即为所测体积的OD值，进而
定量PCR仪引物长度设定
① 引物长度 一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。 在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃ 在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-
引物设计（Primer－Design）的原则
首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length）、产物长度（product length）、序列Tm值（melting t
PCR引物存放时间是多少
最近做PCR实验好几次都扩不出来(郁闷死，以前从没这问题)，反应体系和条件都是以前一见摸索好了的，唯一可能的问题就是试剂出问题了。 PCR引物存放时间，这要看是什么状态，要是粉末的话，在-20度可以存放好几年;要是已经把引物稀释成液体状态的话，存放时间就要短一点了，但也可以存放一年左右的时间，甚至更
引物稀释后能保存多久
引物在溶解前，室温状态下都可以长期保存。使用pH7.5-8.0的TE 缓冲液溶解引物，在-20℃可以保存两个月甚至半年以上，-4℃保存两周一般也没有问题。不建议使用蒸馏水溶解引物，因为有些蒸馏水的 pH 值比较低（ pH4-5 ） ， 引物在这种条件下不稳定。 另外需要提醒的是收到引物后一定先离心，
引物纯化的方法有哪些
如今，引物纯化方式多种多样。各位科研君，每天忙碌奔波于核酸提取、载体构建、蛋白表达等环节，没有深入了解过各种引物纯化方式吧！今天，小编带各位对各种引物纯化方式作下对比。各位科研君在以后的研究中，记得对号入座哦！一般纯化方式目前，采用的主打的引物纯化方式是脱盐纯化。其只能纯化掉引物中的盐分，并不能去除
引物延伸实验问题与解答
1)什么是引物延伸实验？引物延伸实验用于定量mRNA的量，测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5`-端， 确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域， 随后用RNA作为模板，用反转录酶延伸引物得到cDNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。cDNA的
如何计算引物的Tm值？
引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。长度为25base以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) –
引物稀释后能保存多久
引物在溶解前,室温状态下都可以长期保存.使用pH7.5-8.0的TE 缓冲液溶解引物,在-20℃可以保存两个月甚至半年以上,-4℃保存两周一般也没有问题.不建议使用蒸馏水溶解引物,因为有些蒸馏水的 pH 值比较低（ pH4-5 ） , 引物在这种条件下不稳定. 另外需要提醒的是收到引物后一定先离心,
PCR反应引物浓度多少合适
储备液一般是100uM，也有稀释成10uM的。反正做PCR的最终其工作液终浓度范围是0.2μmol/L左右。我一般把引物稀释成10uM，25微升PCR体系一般加0.4-1.0微升的引物。