蛋白质在哺乳动物细胞中表达实验
实验材料载体（如 CDM 8）实验步骤1. 将目的基因亚克隆至合适的载体中得到所需的重组 DNA 。用小量法（5 ml 培养液）或用 CsCl／溴化乙锭离心法纯化重组 DNA。2. 在转染的前一天，将 COS-7 细胞以约 20% 汇片的数量种入含 DMEM-2 CS 培养基的 100 mm 培养皿（这样在第二天细胞可长至约 50% 汇片）。让细胞生长过夜至约50% 汇片。3. 使用前（对每一个待转染的 100 mm 培养皿中的 COS 细胞），将 5 ml 37℃ 的 DMEM-2 NS 培养液与 0.2 ml DEAE-葡聚糖/氯喹溶液彻底混匀，再加入 5~10 重组 DNA 混匀。4. 吸出 COS 细胞的培养液，向每一个 100 mm 培养皿加入步骤 3 制备的 DMEM-2 CS／DEAE-葡聚糖／DNA。温育细胞 3~4 h。用差相显微镜观察细胞。DEAE-葡聚糖将引起细胞收缩并变得空泡化。长时间的孵育可提高转染效率......阅读全文
实用哺乳动物细胞培养手册（三）
细胞培养环境1、实验室设计 细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受 其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响， 要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌 操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作
实用哺乳动物细胞培养手册（下）
细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒清洗在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。微生物产品附带杂物，上次细胞残留物及非营养成分的化学物质，均能影响培养细胞的生长。因此对新使用玻璃器 皿和重新使用的培养器皿都要严格彻底的清洗，且要根据器皿的组成材料不同，选择不同 的清洗方法。玻璃器皿的清
从哺乳动物细胞或组织分离DNA
1. 根据样品类型，从下列方法中选一个作为步骤 1 进行操作。(1) 细胞样品① 单层培养的细胞以用冰预冷的 TBS 将单层细胞洗涤 2 次，用刮棒把细胞刮入约 0.5 ml 的 TBS 中，将细胞悬液转移到冰浴的离心管中，用 1 mlTBS 冲洗培养皿，并入离心管中的细胞悬液。于 4℃ 以
实用哺乳动物细胞培养手册（上）
细胞培养基本概念细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结 构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞群。细胞培养目的与用途1、科学研究：药物研究开发与基础研究 药物研究与开发(1) 新药筛选：如化学合成药物药效研究、中药有效成分筛选与鉴定
实用哺乳动物细胞培养手册（一）
细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒清洗在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。微生物产品附带杂物，上次细胞残留物及非营养成分的化学物质，均能影响培养细胞的生长。因此对新使用玻璃器 皿和重新使用的培养器皿都要严格彻底的清洗，且要根据器皿的组成材料不同，选择不同 的清洗方法。玻璃器皿的清
哺乳动物细胞胞质RNA的分离
试剂、试剂盒 冰冷的磷酸盐缓冲液 NaCl KCl Na2HP04•7H20 KH2PO4 冰冷的裂解缓冲液： LTris-HCl
实用哺乳动物细胞培养手册（四）
细胞培养无菌操作基本技术无菌操作技术分为三个部分：工作环境及表面的处理，细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理及培养液与培养细胞的处理。工作环境的处理 使用层流超净工作台是最经济有效的手段。超净工作台正常工作时，向下的气流可阻挡外界空气污染物进入超净台。（1）实验前，无菌室及无菌操作台用紫外灯照射 30-
哺乳动物细胞的简介和生物特征
哺乳动物细胞（mammalian cell)来自哺乳动物体的细胞。它的培养由于可用来大量生产疫苗、重组蛋白和其他医疗产品而倍受重视。已建成许多重要的细胞系，这些细胞来自鼠、人、猴等。 哺乳动物是全身被毛,运动快速,恒温,胎生和哺乳的脊椎动物.它是脊椎动物中躯体结构,功能和行为最复杂的一个高等动
哺乳动物细胞的RNAi技术策略(1)
目前RNAi技术已经进入了生物科学研究的许多领域，成为了一种主要的生物学研究工具，发展得相当迅速，并受到了此次诺贝尔奖评审委员会的青睐，获得2006年诺贝尔奖医学/生理奖。然而这一才历经十个年头的技术依然对于许多研究人员来说还是很陌生的，以下是有关 i技术在哺乳动物细胞中应用的具体设计策略，主要
哺乳动物细胞的细胞培养温度
维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定而适宜的温度；不同种类的细胞对培养温度要求也不同。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能
哺乳动物细胞的RNAi技术策略(3)
5. si 表达框架si 表达框架(si expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的si 表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这个方法最早是由Castanotto和其同事(5)采用，包括一个 pol III启动子，一段发夹结构si ，一个
实用哺乳动物细胞培养手册（二）
消化液：分离组织和分散细胞。常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠 (EDTA) 两种溶液。可以 单独使用，也可以混合使用。（1）胰蛋白酶溶液胰蛋白酶（简称胰酶）是一种黄白色粉末，易潮解，应放置冷暗干燥处保存。目前应用的胰蛋白酶主要来自牛或猪的胰腺。胰酶的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞相
哺乳动物细胞培养过程－－培养条件
哺乳动物细胞培养过程哺乳动物细胞在培养过程中会经过组织提取，原代培养，传代培养等过程。传代培养会根据具体情况分为细胞株培养和细胞系培养。如下对各个过程进行简述：原代培养：从动物机体取出组织后切碎，经过各种酶（常用胰蛋白酶），螯合剂（常用EDTA）结合机械方法（吸液管反复吸吹）处理，分散成单细胞，置于
哺乳动物细胞培养过程－－培养条件
哺乳动物细胞培养过程 & 培养条件导语：哺乳动物细胞在培养过程中会经过组织提取，原代培养，传代培养等过程。传代培养会根据具体情况分为细胞株培养和细胞系培养。哺乳动物细胞培养过程哺乳动物细胞在培养过程中会经过组织提取，原代培养，传代培养等过程。传代培养会根据具体情况分为细胞株培养和细胞系培养。如下对各
从哺乳动物细胞中制备核和细胞质提取物
核提取物的制备核提取物制备优化细胞质（S-100)组分的制备实验方法原理实验材料转瓶或单层培养的哺乳动物细胞（如HeLa细胞） 试剂、试剂盒PBS
从哺乳动物细胞中制备核和细胞质提取物
实验方法原理 实验材料 转瓶或单层培养的哺乳动物细胞（如HeLa细胞）试剂、试剂盒 PBS低渗缓冲液高盐缓冲液含1. 2 mol L KCl透析缓冲液液氮仪器、耗材 贝克曼 JS4. 2 转子或相当的转子50 mL 圆锥形刻度聚丙烯离心管（对较小体积的提取物也可用 15 mL 的离心管）Doun
从哺乳动物细胞中制备核和细胞质提取物
核提取物的制备 核提取物制备优化 细胞质（S-100)组分的制备 实验方法原理 实验材料
血清在动物细胞培养中的作用
血清在动物细胞培养中起着多方面的作用： ①提供细胞生存和增殖所必需的生长调节因子。 ②补充基础培养基中没有或量不足的营养成分。 ③含有一些可供贴壁细胞型细胞贴壁生长的基质成分。 ④提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等。 ⑤在一些情况下，中和毒性物质
杆状病毒系统蛋白质表达实验
基本方案 小规模表达 辅助方案1 蛋白质生产高峰期的确定 辅助方案2重组蛋白的代谢标记 基本方案2 重组蛋白大规模生产 实验方法原理
用于蛋白质表达的标签实验2
三、标签的去除由于蛋白标签可能会干扰目标蛋白质的正常功能，所以在完成其促进溶解或亲和纯化的作用后，标签的去除对于生物学和功能研究很有帮助，对 GST 或 MBP 这样的大标签尤其如此，尽管有一些例子显示融合了标签的蛋白质更易结晶 (Smythetal.，2003)。大多数用来向目标蛋白质添加标签的商
用于蛋白质表达的标签实验（二）
二、可溶性标签在重组蛋白表达中，特别是当在细菌中表达真核蛋白时，主要的瓶颈在于蛋白质的正确折叠与可溶性。一些可溶性蛋白已被作为标签用来改善目标蛋白质的折叠。这些标签应该与其他方法共同使用来促进蛋白质的折叠，如诱导后降低培养温度或者共表达伴侣蛋白（BaneyxandMujacic,2004;deMar
杆状病毒系统蛋白质表达实验
实验方法原理 分析方案依赖于表达蛋白的天然特性。实验材料 草地夜蛾（Sf9）细胞高滴度的重组杆状病毒储液试剂、试剂盒 PBS1×SDS样品缓冲液仪器、耗材 含 10% 胎牛血清（FBS）的TNM-FH昆虫培养基60 mm 组织培养皿27℃ 培养箱（湿度可选）15 ml 聚丙烯离心管带有 GH-3.7
用于蛋白质表达的标签实验（一）
一、设计具有标签的蛋白质时需要考虑的因素亲和力和可溶性的选择在大肠埃布氏菌中生产外源蛋白时面临两个挑战: 一? 是所用蛋白质表达系统的表达水平很低; 二是所表达的蛋白质被错误折叠进不溶性的聚集体—包涵体中。弱启动子、低转录起始或稀有密码子的存在引起的表达问题都可以通过在装配过表达质粒时将矫正
Tornado表达系统实现RNA高水平表达和功能活性
RNA适配体是一种短RNA，可通过结合细胞内的分子或蛋白质调节细胞内进程。尽管RNA适配体具有潜在的应用价值，但它并没有其他RNA技术广泛应用，主要问题是它们不能高浓度表达，从而不能有效调节蛋白质功能，同时也阻碍了RNA装置，例如RNA代谢物生物传感器在哺乳动物细胞中的应用。通常，基于RNA的生
2.1.3－哺乳动物细胞胞质RNA的分离
下述方法是纯化组织培养细胞胞质 RNA 的 简便并行之冇效的方法 ，此方法出现在 RNA 分离的较早阶段，主要步骤即离心去除细胞核试剂、试剂盒冰冷的磷酸盐缓冲液NaClKClNa2HP04•7H20KH2PO4冰冷的裂解缓冲液： LTris-HClNaClMgCL2NkmidetP-40胎盘RNas
真核细胞表达系统3
由于腺病毒易于培养、纯化，宿主范围广，故采用该类病毒构建的载体被广泛应用腺病毒载体的构建依赖于腺病毒穿梭质粒和包装载体之间的同源重组。但是哺乳动物细胞内的这种同源重组效率很低，利用细菌内同源重组法构建重组体效率会大大提高，即将外源基因插入到腺病毒穿梭质粒中，形成转移质粒，将其线性化后与腺病毒包装质粒
蛋白质的表达、分离、纯化实验——层析法
蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。实验方法原理携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在 37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共
哺乳动物细胞热刺激反应中染色质空间构象改变的新解释
热刺激是细胞经常面对的环境刺激，热刺激反应是所有细胞普遍具有的刺激反应机制。热刺激诱导的广泛的转录调控是热刺激反应的重要组成部分。近年来，科学家从表观遗传学的各层面对其机制开展了研究。当前，针对染色质空间构象这一重要的表观遗传学层次，是否在热刺激反应中发挥作用以及可能的具体作用形式存在争议。此外
哺乳动物细胞(mammalian－cell)总RNA的分离2
3）于0℃以5000g离心10分钟沉淀RNA，弃上清，用含0.1mol/L 乙酸钠（pH5.2）的70％乙酸洗涤沉淀，用自动微量移液器尽可能将乙醇吸尽， 随后于室温放置几分钟，晾干沉淀。切勿抽干沉淀，因为干的核酸沉淀很难溶解。4）每个直径为90mm的培养皿或每107细胞加 200μl 50mmol/
哺乳动物细胞培养有没有厌氧的
哪有厌氧的哺乳动物啊开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中,此浓度的CO2与培养液PH缓冲体系中的NaHCO3浓度相平衡,二氧化碳既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值