DIG试剂盒杂交实验

实验概要Southern技术是指以Southern名字命名的DNA转移杂交技术。它可用于基因组特定DNA序列的定位,可以测定相关片段的同源性、可以从c库、基因组文库中筛选完整基因等。用一种或多种限制性内切酶对基因组DNA加以切割,通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段,随后,使DNA在原位变性,并从凝胶转移至固相膜,用已知核苷酸片段加以标记作为探针,通过分子杂交来检测待测样品中是否存在互补的核酸序列。该技术已成为分子生物学中一类重要的检测手段。下面介绍利用DIG试剂盒进行杂交的方法。主要试剂变性液 :0.5MNaOH、1.5MnaCl中和液:0.5Mtris-HCL,pH7.0、3MnaCl20×SSC溶液预杂交液:Blocking溶液(试剂盒带)杂交液(含5-25ng/ml,DIG标记探针的预杂交液)low stringence buffer(2×SSC,0.1%SDS)high stringence buffer(0.5×SSC,0......阅读全文

DIG试剂盒杂交实验

实验概要Southern技术是指以Southern名字命名的DNA转移杂交技术。它可用于基因组特定DNA序列的定位,可以测定相关片段的同源性、可以从c库、基因组文库中筛选完整基因等。用一种或多种限制性内切酶对基因组DNA加以切割,通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段,随后,使DNA在原位变性,并从凝胶转移

非放射性Dig-dUTP

[原理]DNA是通过异羟基洋地黄毒苷(digoxigenin,Dig)配基标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)随机插入结合而被标记。dUTP通过间臂连结类固醇半抗原异羟基洋地黄毒苷酸基,形成Dig-dUTP,杂交反应后,杂交的靶DNA通过酶联免疫法与一个抗体复合物[抗异羟基洋地黄毒苷配基碱性磷酸酶

RNA探针的合成方法和合成效率检测

在RNA的杂交检测实验中,应用标记的RNA 探针将获得高灵敏度的杂交检测结果,与DNA 探针相比,检测灵敏度提高10-100倍。因为对于不同的杂交体类型来说,RNA-RNA杂交体的结合强度高于RNA-DNA和DNA-DNA杂交体。对于通过Northern blots检测低浓度mRNA,以及原

RNA探针合成方法和合成效率检测方法介绍

相关专题制备RNA探针在RNA的杂交检测实验中,应用标记的RNA 探针将获得高灵敏度的杂交检测结果,与DNA 探针相比,检测灵敏度提高10-100倍。因为对于不同的杂交体类型来说,RNA-RNA杂交体的结合强度高于RNA-DNA和DNA-DNA杂交体。对于通过Northern blots检测低浓度m

选择合适的标记方法

地高辛(DIG)产品选择指南——选择合适的标记方法标记DNA探针如果您有足够量的高纯度模板,建议您采用随机引物标记方法的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I 和II。这两个试剂盒包含了标记、封闭、杂交和检测所需要的所有试剂,是

PCR实验操作

PCR是极为重要的DNA增殖技术,应用层面非常广,其中包括了核酸探针的制备。如果一段DNA已经被次选殖至载体上,要以PCR扩增这段DNA时,可根据质体multiple cloning sites两边的序列,选用适当的核酸引子 (universal primers) 进行扩增反应;比较常用的引子包括S

PCR实验操作

PCR实验操作     PCR是极为重要的DNA增殖技术,应用层面非常广,其中包括了核酸探针的制备。如果一段DNA已经被次选殖至载体上,要以PCR扩增这段DNA时,可根据质体multiple cloning sites两边的序列,选用适当的核酸引子 (universal primers) 进行扩增反

以酶联免疫反应与碱性去磷酸酶呈色反应侦测杂合讯息

进行杂合反应时所使用的探针若为放射性物质所标定者,杂合讯息可经由放射显影术 (autoradiography) 侦测出来;若为DIG所标定者,则需借助anti-DIG抗体与碱性去磷酸酶 (alkaline phosphatase, AP) 的conjugate,并利用碱性去磷酸酶的酵素活性转

以酶联免疫反应与碱性去磷酸酶呈色反应侦测杂合讯息

以酶联免疫反应与碱性去磷酸酶呈色反应侦测杂合讯息       进行杂合反应时所使用的探针若为放射性物质所标定者,杂合讯息可经由放射显影术 (autoradiography) 侦测出來;若为DIG所标定者,则需借助anti-DIG抗体与碱性去磷酸酶 (alkaline phosphatase,

Northern杂交试验指导手册(5)-RNA探针制备

五、RNA探针制备(根据the DIG system user's guide)A. 地高辛标记的体外转录试剂及其配制(试剂盒提供):10× NTP标记混合物:in Tris-HCl (pH 7.5)10mmol ATP10mmol CTP10mmol GTP6.5mmol UTP3.5mm

探针的非放射性标记技术1

核酸探针是指能与特定核酸序列发生特异性互补的寡核苷酸链。核酸探针有双链DNA探针、单链DNA 探针、RNA探针和寡核苷酸探针。特异性探针来源于目的核酸的酶切片断、dd-PCR等差异显示中出现的差异片断、AFLP、RFLP、RAPD、SSR、CFLP等标记实验中出现的特异性基因标记片断。可以通过人

地高辛检测方法

地高辛检测试剂盒 DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I货号: 11745832910罗氏科学应用部(Roche Applied Science)是最早致力于向用户提供非放射标记技术的公司之一,让更多的科研工作者们可以避免使用危

DNA探针的标记实验

实验方法原理 分子杂交是核酸链以碱基配对规则的一种结合方式,是核酸的重要理化特性。利用分子杂交这一特性来对特定核酸序列进行检测,必须将杂交链中的一条用某种可以检测的进行标记,这条链就称为核酸探针。因此,核酸探针的制备是分子杂交技术的关键。放射性同位素标记是最早采用的也是目前最常用的核酸探针标记方法。

DNA探针的标记实验

探针标记法             实验方法原理 分子杂交是核酸链以碱基配对规则的一种结合方式,是核酸的重要理化特性。利用分子杂交这一特性来对特定核酸序列进行检测,必须将杂交链中的一

Northern杂交试验指导手册(3)

试验程序1.在纯净工作台上将5ml含AP的LB液体培养基加入到一10~15ml通气良好的试管中,然后将前述经鉴定含有目的 DNA片断的转化细菌接种其中,37℃下振荡培养过夜。2.取1.5ml培养物置于一微量离心管中,在4℃下12000rpm离心2min.,弃去上清液,使细菌沉淀尽可能干燥。3.将细菌

DNA探针的标记实验

核酸探针分子杂交是指具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下可按碱基互补原则形成双链,此杂交过程是高度特异的。核酸探针根据核酸的性质,可分为DNA和RNA探针;根据标记物不同,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针两大类;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀

Northern杂交试验指导手册(7)-杂交结果检测

方法一、化学发光检测试剂及其配制:洗膜缓冲液:100mmol Maleic acid150mmol NaCl0.3%(v/v) Tween20pH 7.5Maleic acid缓冲液:100mmol Maleic acid150mmol NaClpH 7.5封闭液:5% (w/v) SDS17mmo

核酸杂交法检测病原微生物

核酸杂交技术是根据两条互补的核苷酸单链可以杂交结合成双链的原理所建立,用一段已知序列的放射性或非放射性标记的核苷酸单链做探针,与待检标本中的DNA杂交来探查待检标本中有无与之相互补的核酸。该方法特异性高,但敏感性低于PCR方法。  本实验学习用非放射性标记物-地高辛(DIG)标记DNA片段作探针,用

DNA斑点杂交方法(二)

核酸杂交法检测病原微生物  核酸杂交技术是根据两条互补的核苷酸单链可以杂交结合成双链的原理所建立,用一段已知序列的放射性或非放射性标记的核苷酸单链做探针,与待检标本中的DNA杂交来探查待检标本中有无与之相互补的核酸。该方法特异性高,但敏感性低于PCR方法。  本实验学习用非放射性标记物-地高辛(DI

核酸杂交法检测病原微生物

核酸杂交技术是根据两条互补的核苷酸单链可以杂交结合成双链的原理所建立,用一段已知序列的放射性或非放射性标记的核苷酸单链做探针,与待检标本中的DNA杂交来探查待检标本中有无与之相互补的核酸。该方法特异性高,但敏感性低于PCR方法。  本实验学习用非放射性标记物-地高辛(DIG)标记DNA片段作探针,用

原位杂交法测定TNF的mRNA

实验概要本实验用原位杂交法测定了TNF的mRNA。主要试剂1. 原位杂交   1) TNF-DNA探针   2) 地高辛标记液试剂盒   3) 杂交液:60%去离子甲酰胺,300mmol/L NaCl、30mmol/L柠檬酸钠、10mmol/L EDTA 25mmol/L NaH2PO4(pH7.4

Northern杂交试验指导手册(5)

 E.杂交建议杂交条件:探针浓度50~100ng/ml,温度68℃过夜。1.将印迹膜置于装有预杂交液的杂交袋中(每100cm2膜20ml预杂交液),封好杂交袋,在设定的杂交温度下预杂交至少1小时。2.将探针在沸水浴中变性10min.(探针一经变性,立即使用),用预杂交液稀释成设定浓度。3.将杂交袋中

DNA实验技术:原位杂交实验要求及步骤2

三、操作步骤(一)取材、冰冻切片:将动物以3%戊巴比妥钠麻醉,打开胸腔,暴露心脏,刺破右心耳,将针尖刺入左心室用生理盐水灌注(灌注量约为动物体重的2倍),再注入等量的4%多聚甲醛。(见图2-7)。取材,置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1M PBS浸泡冲洗4-5次(换液:1次/hr)。将组织块入

地高辛标记RNA常用的方法介绍

地高辛标记RNA常用的方法是将DIG与UTP共价结合形成DIG-UTP,以DIG-UTP、ATP、CTP、GTP为底物通过RNA聚合酶T7、SP6经体外转录合成标记RNA。此法多用于RNA探针的制备,一般每20~25个核苷酸可引入一个地高辛分子。5'末端标记法5'末端标记法是通过化学

原位杂交实验要求及步骤(二)

三、操作步骤(一)取材、冰冻切片:将动物以3%戊巴比妥钠麻醉,打开胸腔,暴露心脏,刺破右心耳,将针尖刺入左心室用生理盐水灌注(灌注量约为动物体重的2倍),再注入等量的4%多聚甲醛。(见图2-7)。取材,置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1M PBS浸泡冲洗4-5次(换液:1次/hr)。将组织

OsAGAP-mRNA原位杂交

实验概要本实验以OsAGAP mRNA为试材介绍了原位杂交技术,包括:原位杂交正义、反义探针制备,原位杂交探针半定量,植物材料的固定与石蜡包埋,切片与粘片,杂交和显色等过程。实验步骤1. OsAGAP原位杂交正义、反义探针制备对OsAGAP cDNA全长在GenBank中做BLAST分析,选取特

如何设计引物(二)

Nucleotides:Stocks of nucleotides for PCR (or other procedure) are NEARLY ALWAYS dNTPs (deoxynucleotides), and concentrations is almost always given i

Northern杂交操作步骤和DNA探针的制备与标记(2)

(4) 将1 ~ 2 μl RNA 上样缓冲液加到乙二醛化的RNA 样品中,然后马上把RNA样品加到凝胶加样孔中,留着两边最外面的两个孔不要加样。将RNA 相对分子质量标准参照物加到最外面的孔中。(5) 以5V/cm 的电压进行电泳,直到溴酚蓝迁移大约8 cm。(6) 将凝胶放在保鲜膜上,在紫外灯下

PCR扩增制备带标记探针

实验概要用标记脱氧单核苷酸部分代替PCR反应体系中的脱氧核苷酸(一般是带标记的dUTP代替dTTP),经PCR扩增后标记基团随机搀入扩增产物-DNA探针中。这样使探针浓度高,可检测标记基团量多,灵敏度高,与缺口平移法制备探针相比,具有方便简捷的特点,并且由于具高灵敏度因此在检测低丰度,低拷贝数的目的

地高辛对探针的标记

实验概要本实验拟通过随机引物及PCR方法,将DNA探针片段用DIG标记,进一步掌握探针的标记技术。实验原理带有地高辛标记的dUTP(图1)通过缺口翻译、随机翻译或PCR等反应而使探针核酸片段带有地高辛,进一步可与带有AP、CSP等各种抗地高辛抗体复合物发生免疫反应,使探针上带有AP等分钟,进一步能催