利用寡核苷酸延伸法进行纯化DNA片段的放射性标记
随机引物法：利用寡核苷酸延伸法进行纯化DNA片段的放射性标记1. 在一个0.5ml的微量离心管中加入溶于30μl水的模板DNA(25ng)及1μl随机脱氧核苷酸引物（约125ng）。盖紧微量离心管，置于沸水浴中2min。2. 将微量离心管移至冰上放置1min，4℃下离心10s使引物与模板的混合物沉降至管底，将微量离心管重新置于冰上。3. 在引物与模板的混合物中加入：5 mmol/L dNTP溶液 1μl5×随机引物缓冲液 &n......阅读全文
从M13噬菌体模板合成固定长度的单链DNA探针
实验材料 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段限制性内切核酸酶模板 DNA寡核苷酸引物试剂、试剂盒 乙酸铵DTTEDTA乙醇NaCl酚氯仿TBE 电泳缓冲液Tris-ClKlenow 基础缓冲液dNTP 溶液仪器、耗材 变性聚丙烯酰胺凝胶或碱性琼脂糖凝胶黏性贴片或磷光黏性贴片Sephad
从M13噬菌体模板合成固定长度的单链DNA探针
实验材料大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段限制性内切核酸酶模板 DNA寡核苷酸引物试剂、试剂盒乙酸铵DTTEDTA乙醇NaCl酚氯仿TBE 电泳缓冲液Tris-ClKlenow 基础缓冲液dNTP 溶液仪器、耗材变性聚丙烯酰胺凝胶或碱性琼脂糖凝胶黏性贴片或磷光黏性贴片Sephadex
DNA片段纯化与回收常见问题分析
Q：利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到目的片段？A：可能有以下几个原因： 1. 胶块未完全溶解，可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解； 2. 胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收； 3. 电泳缓冲液pH太高，硅基质膜在高盐低pH结合DNA，如pH太高，应作适
PCR测序方法你知道几种？（一）
自从 Sanger等(1975)引人双脱氧核苷三磷酸( ddNTP)作为链终止剂,DNA序列测定技术得到迅速发展。 ddNTP在DNA聚合酶作用下,通过其5三磷酸基团可以掺入到正在延伸的DNA链中,但由于其脱氧核糖3位置缺少一个羟基,因此不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键,使得DNA链的延伸
DNA重组（DNA－recombination）技术：DNA序列测定2
目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法（双脱氧链终止法）和Maxam（1977）提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都同样生成相互独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组核苷酸都有共同的起点，却随机终止于一种（或多种）特定的残基，形成一系列以某一特定核苷酸
DNA序列测定的技术和策略
目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。由于DNA上的每一个碱
用大肠杆菌－Klenow－片段标记合成的寡核苷酸实验
试剂、试剂盒 甲酰胺加样缓冲液 大肠杆菌 DNA 聚合酶 IKlenow 片段 变性聚丙烯酰胺凝胶 寡核苷酸引物 寡核苷酸模板 [α-32P]dNTP
用大肠杆菌－Klenow－片段标记合成的寡核苷酸实验
试剂、试剂盒 甲酰胺加样缓冲液大肠杆菌 DNA 聚合酶 IKlenow 片段变性聚丙烯酰胺凝胶寡核苷酸引物 寡核苷酸模板[α-32P]dNTP仪器、耗材 磷荧光粘贴标签水浴或模块实验步骤 材料溶液和缓冲液稀样贮存液至适当浓度。甲酰胺加样缓冲液10XKlenow 缓冲液酶与缓冲液大肠杆菌 DNA 聚合
DNA序列测定技术
DNA序列测定技术序列测定的技术和策略Sanger双脱氧链终止法Maxam－Gilbert DNA化学降解法测序策略 目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成互相独立的
DNA序列测定技术
DNA序列测定技术序列测定的技术和策略Sanger双脱氧链终止法Maxam－Gilbert DNA化学降解法测序策略目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成互相独立的若干
DNA测序的测序原理
DNA测序的测序原理是：利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸
定点诱变实验
基本方案 利用PCR引物点突变 实验材料 DNA 试剂、试剂盒
DNA片段的回收实验——树脂回收法
目的DNA片段的回收技术是重组DNA中的关键技术，回收是指从电泳介质中纯化出目的片断。实验方法原理本方法特别适合于PCR片段的回收，具有纯度高、操作简洁等特点，经此方法回收的片段可有效的用于重组载体构建。通过15分钟的纯化过程，PCR产物即能被有效地从含引物二聚体、非特异性扩增引物片断等混合物中分离
DNA片段的回收实验——微量柱法
实验材料DNA片段试剂、试剂盒纯化试剂盒异丙醇仪器、耗材离心机电泳仪电泳槽取液器微量真空装置抽滤装置实验步骤1. 紫外灯下从胶上切下目的片段，放入一Epphendof管中。2. 离心管在－20℃冷却5~10分钟。3. 将微量柱下套上一Epphendof管，将冷却的胶条装进微量柱中，4℃12 0
定点诱变实验
实验材料 DNA试剂、试剂盒 TE寡核苷酸引物质粒dNTPDNA聚合酶氯仿石蜡油无水乙醇仪器、耗材 离心管热循环仪离心机实验步骤 1. 利用突变区两侧的限制性内切酶位点将待诱变的DNA片段亚克隆进高拷贝数的载体中。 2. 用小量制备的质粒提取模板DNA，用TE缓冲液重悬100 ng DNA至终浓
为什么需要对DNA进行纯化
为什么需要对DNA进行纯化质粒DNA纯化的试验原理：溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加， 从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多溴化乙锭，直至达
DNA纯化实验——DNA凝胶回收试剂盒纯化法
DNA纯化可用于：（1）获得高纯度的DNA；（2）浓缩DNA；（3）测序、遗传信息分析等分子生物学应用。实验方法原理本试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中提取多至 8 μg DNA（70 bp-10 Kb），回收率为 60-85%。琼脂糖凝胶在温和的缓冲液(DE-A 溶液)中溶解，其中的保护剂能防止线状 D
利用－Polybrene－进行－DNA－转染实验
利用 Polybrene 进行 DNA 转染实验 实验材料 指数生长的哺乳动物细胞
利用－Polybrene－进行－DNA－转染实验
下面讲述的 Polybrene 与 DMSO 转染的方法是 Aubin 等（1997) 方法的改进。利用此方法可以有效地将质粒 DNA 转染中国仓鼠卵巢细胞与角化细胞，产生的转化体比磷酸钙-DNA 沉淀物方法的多 15 倍。但是使用高分子量 DNA 时两种方法的转染效率无明显差别。本实验来源于分子克
利用－Polybrene－进行－DNA－转染实验
实验材料 指数生长的哺乳动物细胞试剂、试剂盒 DMSO(30%) 含血清培养基Giemsa 染液甲醇Polybrene丁酸钠要转染的 DNA仪器、耗材 最低基础培养基组织培养皿实验步骤 材料缓冲液与溶液贮存液、缓冲液与试剂的成分见附录 1。稀释贮存液至所需浓度。DMSO(30%)/含血清培养基第 3
基于－PCR－的差减－cDNA－克隆实验
差减克隆是分离和鉴定两个细胞群中差异表达的 mRNA 的有效技术。相比较的细胞类型是［＋］（或 测 试）细胞和［-］（或驱动）细胞，在测试细胞中表达而不在驱动细胞中表达的 mRNA 将被分离出来。必需的差减次数主要取决于 cDNA 的多样性。多样性是指每一个细胞类型中不同的cDNA 或 cDNA 片
定点诱变实验——基本方案
定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。实验材料DNA试剂、试剂盒TE寡核
小片段法进行基因分型（一）
摘要： 背景：用于基因分型的高分辨率熔解曲线技术既简单又有效。在以熔解为基础的方法中，探针法是基因分型的黄金标准，可以将等位基因与目标的匹配完全区分开。小片段基因分型法是代替探针的基因分型法。异源双链核酸分子的存在使得检测纯合子变得容易，其熔解峰的形状有明显的改变。纯合子G/C或A/T的基
小片段法进行基因分型（二）
结果： 图1显示的是校正之前的完整的熔解峰显示。 从低温和高温内标及扩增子熔解的中部区分熔解信号。图1：派生熔解曲线显示校准和扩增子的熔解峰。左边和右边的峰是校准内标的峰。94的熔解剖面图，接近76℃，从独立的PCR反应中生成。校准分子没有对其，纯合子的扩增峰没有清楚的分开。中部最窄且
分子杂交技术（二）
四、核酸探针的标记和检测 分子杂交是核酸链间碱基配对规则的一种结合方式，是核酸的重要理化特性。利用分子杂交这一特性来对特定核酸序列进行检测，必须将杂交链中的一条用某种可以检测的分子进行标记，这条链就称为核酸探针。因此，核酸探针的制备是分子杂交技术的关键。最早采用的也是目前最常用的核酸探针标记方法是
分子杂交技术（二）
四、核酸探针的标记和检测 分子杂交是核酸链间碱基配对规则的一种结合方式，是核酸的重要理化特性。利用分子杂交这一特性来对特定核酸序列进行检测，必须将杂交链中的一条用某种可以检测的分子进行标记，这条链就称为核酸探针。因此，核酸探针的制备是分子杂交技术的关键。最早采用的也是目前最常用的核酸探针标记方法是
基于－PCR－的差减－cDNA－克隆实验
实验方法原理 实验材料 A 和 B 类细胞的双链 cDNA （ds cDNA）试剂、试剂盒 ALuIRsaIATPT4 多聚核苷酸激酶及其缓冲液DNA连接酶和及其缓冲液Taq DNA聚合酶及其缓冲液寡核苷酸引物4dNTP 混合物驱动 dNTP 混合物转化感受态菌株HEPES缓冲液链霉亲和素溶
基于－PCR－的差减－cDNA－克隆实验
实验方法原理 实验材料 A 和 B 类细胞的双链 cDNA （ds cDNA） 试剂、试剂盒
DNA片段的回收实验——液氮冻融法
实验材料DNA片段试剂、试剂盒纯化试剂盒异丙醇仪器、耗材离心机电泳仪电泳槽取液器微量真空装置抽滤装置实验步骤1. 紫外灯下从胶上切下目的片段，放入一Epphendof管中。2. 离心1 min，加入500 ul TE，200 ul 酚/氯仿混匀。3. 离心管放入液氮中10~15 min，再室温
DNA片段探针的应用实验——甲酰胺法
所谓探针，一般是指用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA片段或RNA片段。但要使探针DNA片段能实际应用，必须使DNA或RNA分子带上可识别的信号标志，以便跟踪观察探针与其同源的核苷酸序列发生杂交反应的位置，被探测DNA或RNA片段上的大小、杂交信号的强弱等。目前应用最多的是核素标记方法或非核