沉淀σ32和RNA聚合酶实验
试剂、试剂盒聚乙烯亚胺仪器、耗材SDS-PAGE 电泳装置聚丙烯酰胺小胶实验步骤材料与设备SDS-PAGE 电泳装置聚丙烯酰胺小胶（10%)试剂聚乙烯亚胺（PEI)(6% 储液，pH7.9)(配方，见“试剂的配制”，pp.184~189)操作程序1)0.2%DOC 上清 (见 p.153), 取 6x50-ul 等分试样。各试样分别加入 0、1、2、3、4 和 5ul 6%PEI 储液（使 PEI 浓度分别为 0%、0.12%,0.24%、0.36%、0.48% 和 0,6%), 充分混匀，孵育 5~10 min。2) 用微型离心机离心 1ml，离下沉淀物。如需要，取上清样品，供快速蛋白质斑点印迹试验（见 PP.172?173) 或 SDS 凝胶电泳分析用。做斑点印迹试验应立即进行。结果典型的显示 PEI 滴定实验结果的 SDS 凝胶照片，见图 3-5。展开......阅读全文
用－Taq－DNA－聚合酶进行双脱氧测序反应实验
热稳定 DNA 聚合酶除了在 PCR 反应中应用外，还可用来替代测序酶或 Klenow 片段进行双脱氧链终止法测序。它在高温下（70°C) 进行等温链终止反应的能力可减少测序反应中由于模板 DNA 上引物假结合位点与引物退火错配产生的问题，它还可用于富含二级结构模板的测序。本实验源于分子克隆实验指南
T7RNA聚合酶系统基因表达实验（二）
单病毒感染OST7-1细胞实验方法原理OST7-1 细胞来源于鼠 L929 细胞，能在细胞质中持续表达噬菌体 T7 RNA 聚合酶，因此，应用此细胞系无需用 vTF7-3 感染细胞。实验材料贴壁培养的单层 OST7-1 细胞含有 pT7 控制的外源基因的重组病毒储液试剂、试剂盒完全 MEM-2.5
T7RNA聚合酶系统基因表达实验（一）
本节介绍依赖于在哺乳动物细胞质合成噬菌体T7 RNA聚合酶的瞬时细胞质表达系统。首先，将感兴趣的基因插入质粒中，使其位于T7 RNA聚合酶启动子（PT7）的控制下。在培养过程中，外源基因被高效的 T7 RNA聚合酶转录。这种转染方案适用于分析的目的，因为不需要构建新的重组病毒，所以比较简单。对于大规
荧光RNA随机引物触发的聚合酶链反应实验
差异显示聚合酶链反应（PCR) 可促进在诸多物种中与污染暴露相关的新分子标志物的鉴定。至今，已有多种差异显示方法被详细描述。这里，我们描述了一种改良的RNA 随机引物触发的 PCR 方 法（RNAarbitrarily primed PCR， RAP-PCR) , 主要涉及通过 罗 丹 明（rhod
T7－RNA聚合酶/启动子表达实验
实验材料 载体试剂、试剂盒 氨苄青霉素卡那霉素pGP裂解缓冲液仪器、耗材 培养箱分光光度计离心机实验步骤 1. 将含有待表达基因的片段亚克隆于pT7-5、pT-6或pT7-7中，转化一种标准大肠杆菌菌株，此菌株不应带有可指导T7 RNA聚合酶合成的质粒。转化物涂布于氨苄青霉素平皿，于37℃温育培养
荧光RNA随机引物触发的聚合酶链反应实验（一）
实验步骤 ##一、 从组织和培养细胞中分离RNA1.TRIzol试 剂（Invitrogen)。该试剂含有苯酚和硫氰酸盐化合物，操作时应穿实验服，戴手套，存放于 4°C 。2.氯仿。3.异丙醇。4.乙醇。5.焦炭酸二乙酯（DEPC) 处理的水。6.无DNA试剂盒（Ambion)。贮存于一 20°C
荧光RNA随机引物触发的聚合酶链反应实验（二）
##六、从组织或培养细胞提取 RNARNA可以从各种来源的样本包括培养的细胞（例如神经元细胞、肝细胞等）和组织中分离得到（见 注 释 1) 。 mRNA 的 纯 化 对 FRAP-PCR 方法来说并不需要，因为mRNA 仅占细胞总 R N A 的 3 % 〜5 % (13)。因而在本章所描述
T7－RNA聚合酶/启动子表达实验1
在适宜的条件下，T7 RNA聚合酶/启动子系统表达的基因产物可占细胞总蛋白的25%以上，但多数情况下产量比这个比例要低得多。实验材料载体试剂、试剂盒氨苄青霉素卡那霉素pGP裂解缓冲液仪器、耗材培养箱分光光度计离心机实验步骤1. 将含有待表达基因的片段亚克隆于pT7-5、pT-6或pT7-7中，转化
T7－RNA聚合酶/启动子表达实验3
实验材料噬菌体试剂、试剂盒PEGIPTG仪器、耗材培养箱离心机实验步骤1. 制备从M13噬菌体mGP1-2原种，加PEG溶液沉淀浓缩噬菌体。重悬噬菌体于M9培养基，滴定其滴度。 2. 将由“基本方案”步骤1所得的含T7 启动子表达质粒转化M13许可性大肠杆菌细胞，转化物涂布于氨苄青霉素平皿上，3
实验室常用的耐热DNA聚合酶的相关介绍
耐热DNA聚合酶多应用在PCR技术中。各种耐热DNA聚合酶均具有5'-3'聚合酶活性，但不一定具有3'-5'和5'-3'的外切酶活性。3'-5'外切酶活性可以消除 错配，切 平末端；5'-3'外切酶活性可以消除合成障
T7－RNA聚合酶/启动子表达实验2
实验材料蛋白质试剂、试剂盒氨基酸混合物M9培养基甲硫氨酸甲醇仪器、耗材荧光显微镜离心机分光光度计实验步骤1. 将含有待表达基因的片段亚克隆于pT7-5、pT-6或pT7-7中，转化一种标准大肠杆菌菌株，此菌株不应带有可指导T7 RNA聚合酶合成的质粒。转化物涂布于氨苄青霉素平皿，于37℃温育培养过
聚合酶的分类
可分为以下几个类群:(1)依赖DNA的DNA聚合酶；(2)依赖RNA的DNA聚合酶；(3)依赖DNA的RNA聚合酶；(4)依赖RNA的RNA聚合酶。前两者是DNA聚合酶，它使DNA复制链按模板顺序延长。如在原核生物中仅就大肠杆菌中已被发现的就有三种(分别简称为PolⅠ，PolⅡ和PolⅢ等)；D
聚合酶的分类
可分为以下几个类群:(1)依赖DNA的DNA聚合酶；(2)依赖RNA的DNA聚合酶；(3)依赖DNA的RNA聚合酶；(4)依赖RNA的RNA聚合酶。前两者是DNA聚合酶，它使DNA复制链按模板顺序延长。如在原核生物中仅就大肠杆菌中已被发现的就有三种(分别简称为PolⅠ，PolⅡ和PolⅢ等)；DNA
PCRSSCP（聚合酶链反应单链构象多态）实验步骤
一. 样品的制备1. 设计引物。用Oliga6.0对目的基因进行分析，设定引物，引物长度18-21个碱基，扩增片段以200-300bp最为合适。2. PCR扩增并检测。根据不同的引物挑选适合的退火温度进行PCR扩增。扩增产物用2-2.5%的琼脂糖胶跑水平电泳检测，上样量3-5ul。PCR产物为 10
RNA干涉实验——采用RNA聚合酶Ⅲ启动子表达siRNA分子
实验方法原理因为哺乳动物细胞不具备低等真核生物细胞所具有的扩增 RNAi 信号的机制，因此人工合成或体外转录的 siRNA 分子在细胞内的作用是瞬时性的，不适合用于进行靶基因的表达受到抑制后细胞表型的长期变化观察，也不适于进行文库的筛选。此外，体外制备 siRNA 分子的成本比较高，而且 siRNA
激活的热稳定－DNA－聚合酶进行反转录和－DNA－扩增实验
试剂、试剂盒 RNA寡核苷酸引物 脱氧核苷三磷酸 RT RNA PCR 酶 AccuRT 缓冲液 UNG 琼脂糖 溴化乙锭
激活的热稳定－DNA－聚合酶进行反转录和－DNA－扩增实验
试剂、试剂盒 RNA寡核苷酸引物脱氧核苷三磷酸RT RNA PCR 酶AccuRT 缓冲液UNG琼脂糖溴化乙锭二甲基亚砜乙酸镁去除 RNA 酶的水SYBRGreen I Dye仪器、耗材 琼脂糖凝胶的电泳设备实验步骤 一、材料1. 缓冲液、溶液和试剂琼脂糖二甲基亚砜（见注释 1)(DMSO)溴化乙锭
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ－Klenow片段实验——标记DNA的3‘末端
实验方法原理选用本方法可产生用于放射自显影的32P末端标记分子量标志物。放射自显影带的强度与片段长度无关，标记DNA可稳定数月之久。 实验材料DNA试剂、试剂盒dNTP仪器、耗材水浴锅实验步骤1. 在20 μl 反应体积中，用可产生5’突出端的限制性内切酶消化0.1~0.4 μg DNA。 2.
激活的热稳定－DNA－聚合酶进行反转录和－DNA－扩增实验
本实验介绍激活的热稳定 DNA 聚合酶进行反转录和 DNA 扩增。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。试剂、试剂盒RNA寡核苷酸引物脱氧核苷三磷酸RT RNA PCR 酶AccuRT 缓冲液UNG琼脂糖溴化乙锭二甲基亚砜乙酸镁去除 RNA 酶的水SYBRGreen I Dy
聚合酶链[式]反应
中文名称聚合酶链[式]反应英文名称polymerase chain reaction;PCR定 义通过DNA互补双链解链、退火和聚合延伸的多次循环来扩增DNA特定序列的方法。应用学科细胞生物学（一级学科），细胞生物学技术（二级学科）
DNA聚合酶的特性
良好的热稳定性;70℃ 2h，残留90%活性;93℃ 2h，残留60%活性;94℃ 2h，残留40%活性。5'→3'聚合酶活性，对dATP有优先聚合活性;5'→3'外切酶活性;无3'→5'外切酶活性。
定量聚合酶链反应
中文名称定量聚合酶链反应英文名称quantitative PCR;qPCR定 义将某种已知含量的DNA模板作为内标准进行PCR反应，对待测模板进行定量分析的方法。更灵敏的定量PCR是采用实时PCR方法。应用学科细胞生物学（一级学科），细胞生物学技术（二级学科）
聚合酶的功能特性
聚合作用在引物RNA'-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐个将核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3'-OH与5
RNA聚合酶的类别
通常可根据生物的类别，将RNA聚合酶分为原核生物RNA聚合酶、真核生物RNA聚合酶。原核生物和真核生物的RNA聚合酶有共同特点，但在结构、组成和性质等方面又不尽相同。（1）原核生物RNA聚合酶 研究得最清楚的是大肠杆菌RNA聚合酶。该酶是由五种亚基组成的六聚体（α2ββ'ωσ）分子量约500
耐热DNA聚合酶简介
耐热DNA 聚合酶(Taq DNA 聚合酶)：1969年人们从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离出一种嗜热的水生真菌Thermusaquaticus,能在70~ 75C生长,从该菌分离纯化得到一种耐热的、依赖DNA 的DNA 聚合酶,简称Taq DNA 聚合酶。 耐热DNA聚合酶是一种可抗高温
DNA聚合酶的功能
1）通过核苷酸聚合反应，使DNA链沿5’→3’方向延长（DNA聚合酶活性）[1] 2）催化由3’端水解DNA链（3’→ 5’核酸外切酶活性，用于切除错配的碱基）[1] 3）催化由5’端水解DNA链（5’→ 3’核酸外切酶活性，用于切除引物）[1] 4）催化由3’端使DNA链发生焦磷酸解
DNA聚合酶的特性
DNA聚合酶有多种，E.coli就有三种。通常DNA聚合酶具有以下共同特点： ①需要DNA模板，因此这类酶又称为依赖DNA的DNA聚合酶；②需要RNA或DNA作为引物(primer)，即DNA聚合酶不能从头催化； ③催化dNTP加到引物的3'-OH末端，其速率为1000nt/min，因而DN
聚合酶的分类介绍
可分为以下几个类群:(1)依赖DNA的DNA聚合酶；(2)依赖RNA的DNA聚合酶；(3)依赖DNA的RNA聚合酶；(4)依赖RNA的RNA聚合酶。前两者是DNA聚合酶，它使DNA复制链按模板顺序延长。如在原核生物中仅就大肠杆菌中已被发现的就有三种(分别简称为PolⅠ，PolⅡ和PolⅢ等)；D
DNA聚合酶的应用
E.coli的DNA pol Ⅰ涉及DNA损伤修复，在半保留复制中起辅助的作用。DNA polⅡ在修复损伤中也具有重要的作用。DNA polⅢ是一种多亚基的蛋白质，在DNA新链的从头合成中起复制酶的作用。复制的忠实性问题会影响到翻译的精确性，这种忠实性主要依赖于碱基的特异性配对。据估计每个碱基对将有
DNA聚合酶的发现
在50年代的中期，A. Kornberg和他的同事们就想到DNA的复制必然是一种酶的催化作用，于是决心分离出这种酶并研究其结构和作用机制。为了达到这个目的，他们分离的蛋白，然后加到体外合成系统中即 同位素标记的dNTP、Mg2+及模板DNA，经过大量的工作，于1956年终于发现了DNA聚合酶Ⅰ（