分子克隆蛋白表达实验指南（十九）
Desired pH Volume of 1M K2HPO4 (mL)Volume of 1M KH2PO4 (mL) 5.8 8.591.5 6.0 13.286.8 6.2 19.280.8 ......阅读全文
蛋白质的短暂表达实验
基本方案 实验材料 载体 试剂、试剂盒
Northwestern筛选蛋白表达文库实验
实验方法原理 Northwestern 筛选蛋白表达文库的方法是通过构建 IPTG 可诱导的融合蛋白表达文库（融合蛋白的 N 端由载体序列编码，C 端由克隆到载体的 cDNA 文库编码），进而诱导融合蛋白表达，并将蛋白质固定于硝酸纤维素滤
Northwestern筛选蛋白表达文库实验
Northwestern 筛选蛋白表达文库的方法是通过构建 IPTG 可诱导的融合蛋白表达文库（融合蛋白的 N 端由载体序列编码，C 端由克隆到载体的 cDNA 文库编码），进而诱导融合蛋白表达，并将蛋白质固定于硝酸纤维素滤膜上，以标记的 RNA 探针进行筛选，最终获取能与靶 RNA 分子特异性结合
表达蛋白检测实验_点印迹法
实验方法原理本方案用DNA点迹杂交检测噬斑以鉴定重组病毒。像点迹杂交一样，将感染细胞裂解物印迹在硝酸纤维素膜上（可参考「痘苗DNA检测实验」中「斑点杂交法」）。用可以识别外源基因表达蛋白的抗体与膜一起孵育，用125I 标记的蛋白 A 检测结合的抗体，还可应用化学发光检测系统，如 Amersham E
蛋白质的短暂表达实验
实验材料载体试剂、试剂盒牛血清DMEM葡聚糖PBSDMSOEDTA仪器、耗材培养皿培养箱相差显微镜离心机实验步骤1. 将目的基因亚克隆至合适的载体中得到所需的重组DNA，用小量法（5 ml 培养物）或用CsCl/溴化乙锭离心法纯化重组DNA。2. 将在DMEM-10 CS中生长汇片的COS-7细
分子克隆介绍
各位小伙伴，大家还记得当初进实验室的时候接触到的一个实验技能是什么呢？没错，是 PCR 扩增。小编曾经也是，看着自己亲自配比 PCR 克隆扩增的每个组分，亲眼看着琼脂糖凝胶在紫外透光台上发出的幽绿色的荧光，也是深深被迷住。但总不可能成天就对着这个邪魅的荧光发呆，对吧？看久了，她会爱上你的眼
分子克隆实验引入寄主细胞的常用方法
常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比
杆状病毒系统蛋白质表达实验——小规模表达
实验方法原理分析方案依赖于表达蛋白的天然特性。实验材料草地夜蛾（Sf9）细胞高滴度的重组杆状病毒储液试剂、试剂盒PBS1×SDS样品缓冲液仪器、耗材含 10% 胎牛血清（FBS）的TNM-FH昆虫培养基60 mm 组织培养皿27℃ 培养箱（湿度可选）15 ml 聚丙烯离心管带有 GH-3.7 水平转
蛋白表达
Protein Construct Expression and Purification Procedures (Gimila's Lab) Protein Expression (Mark's Lab) · Purification of GST Fused
简述分子克隆化克隆的选择
①直接筛选：有些载体带有可辨认的遗传标记，能有效地将重组分子与本底区分。例如：有些λ噬菌体携带外源基因后形成的噬菌斑就会从原来的混浊变为清亮；还有些载体分子携带外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的颜色有明显变化，如蓝色变为无色；有些λ噬菌体能侵染甲菌而不能侵染乙菌，携带外源DNA片段后便能侵染乙菌，
表达蛋白检测实验_免疫印迹法
实验方法原理当重组病毒通过噬斑纯化和扩增后，免疫印迹可用于鉴定重组蛋白，并检测其是否有预期的大小以及是否从感染细胞中分泌。下面的步骤是介绍检测非分泌性（细胞内）蛋白的，如果重组蛋白是分泌到培养基中的，可按注解中的步骤操作。实验材料生长至汇片的单层 BS-C-1 细胞重组痘苗病毒储液试剂、试剂盒完全
蛋白质的表达、分离、纯化实验
实验方法原理 携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在 37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程
表达蛋白检测实验_免疫印迹法
实验方法原理当重组病毒通过噬斑纯化和扩增后，免疫印迹可用于鉴定重组蛋白，并检测其是否有预期的大小以及是否从感染细胞中分泌。下面的步骤是介绍检测非分泌性（细胞内）蛋白的，如果重组蛋白是分泌到培养基中的，可按注解中的步骤操作。实验材料生长至汇片的单层 BS-C-1 细胞重组痘苗病毒储液试剂、试剂盒完全
IPTG诱导蛋白表达的实验方法
实验原理：E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节 基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激 活蛋白（CA
IPTG诱导蛋白表达的实验方法
实验原理： E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节 基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激
用于蛋白质表达的标签实验
实验步骤 一、设计具有标签的蛋白质时需要考虑的因素 亲和力和可溶性的选择 在大肠埃布氏菌中生产外源蛋白时面临两个挑战: 一? 是所用蛋白质表达系统的表达水平很低; 二是所表达的蛋白质被错误折叠进不溶性的聚集体—包涵体中。弱启
用于蛋白质表达的标签实验
实验步骤一、设计具有标签的蛋白质时需要考虑的因素亲和力和可溶性的选择在大肠埃布氏菌中生产外源蛋白时面临两个挑战: 一? 是所用蛋白质表达系统的表达水平很低; 二是所表达的蛋白质被错误折叠进不溶性的聚集体—包涵体中。弱启动子、低转录起始或稀有密码子的存在引起的表达问题都可以通过在装配过表达质粒时将矫正
蛋白质的表达、分离、纯化实验
基因重组—层析法 实验方法原理 携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在 37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转
分子克隆常用技术
一、核酸的纯化 在分子克隆的所有操作中，最基本的操作是核酸的纯化。其关键步骤是去蛋白质，通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。每当需要把克隆有某一些所用的酶灭活或去除以便进行下一步时，可进行这种抽提。然而，如要从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化核酸，则要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后
分子克隆常用载体
分子克隆常用载体 DNA片段的克隆需要合适的载体，载体或是质粒，或是噬菌体，或是病毒，通常大多经过人工改造[地的。作为载体必须具备两条件：一是该载体在细胞内必须能自主复制，即必须具备复制原点；二是该载体必须具备适合的酶切位点，且这些酶切位点不在复制原点区域内。以上两条，保证了载体的可繁殖性和可利用
Gateway技术：克隆、表达新方法
Gateway技术提供以下可能： 通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间同时将您的基因转移到多个表达系统在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达一、一种更好的克隆方法Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。这项强大的体外技术大大地简化了基因克
小鼠βactin基因的克隆表达（1）
动物组织RNA的提取实验目的：掌握由动物组织中提取总RNA的方法实验原理：Trizol试剂是一个包含酚、异硫氰酸胍和SDS的单相酸性溶液，其在裂解细胞的同时抑制RNase的活性，随后加入氯仿，酚会大量的溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同，造成DNA分布在下层的氯仿酚溶液中，RNA
小鼠βactin基因的克隆表达（3）
（2）质粒的提取及酶切鉴定分析 质粒的提取按照质粒提取试剂盒的操作步骤进行，然后进行双酶切鉴定。 管号 ① ② 质粒DNA
小鼠βactin基因的克隆表达（2）
实验步骤： （1）目的基因与表达载体的连接反应： ①表达载体和目的片段的酶切 管号 ① ② pGEX 4T-1
原核表达之目的基因克隆
1. 了解实验课题对目的蛋白的要求包括：目的蛋白分子量有多大，表达目的（是蛋白结晶、药剂结合还是制备抗体，不同目的对蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞内表达还是分泌表达，是组成型表达还是诱导型表达；另外，还要了解蛋白表达后需要采用什么样的方式进行纯化，纯化标签有多大，蛋白纯化后是否需要将标签去除（即
原核表达——基因克隆技术
原核表达可以用于检测（1）发生在原核生物内的基因表达。（2）通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。实验方法原理一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株。如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag
Gateway技术：克隆、表达新方法
Gateway技术提供以下可能： 通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间 同时将您的基因转移到多个表达系统 在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达 一、一种更好的克隆方法 Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。这项强大的体外技术大大
小鼠βactin基因的克隆表达（4）
实验步骤：（1）诱导靶蛋白表达分别挑取对照菌和重组菌1~2个菌落，接入5ml含Amp（30μg/ml）的LB培养液，37℃振荡培养过夜。取5ml过夜培养物接入500ml含Amp（30μg/ml）的LB培养液，37℃振荡培养2h以上，至对数中期（A550=0.5~1.0）。向诱导管中加入IPTG使其浓
Gateway技术：克隆、表达新方法
Gateway技术提供以下可能： 通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间 同时将您的基因转移到多个表达系统 在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达一、一种更好的克隆方法Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。这项强大的体外技术大大地简化了基
硫氧还原蛋白融合蛋白的表达和纯化实验
实验材料 融合蛋白试剂、试剂盒 氨苄青霉素甘油色氨酸仪器、耗材 电泳仪培养箱摇床试管实验步骤 1. 将编码目的序列的DNA片段克隆于pTRXFUS或hpTRXFUS质粒上的trxA基因3‘末端，构建符合读框的融合基因，或者于pALtrxA-781的单一Rsr 2位点上插入短肽编码序列。2. 用含